(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210366028.1 (22)申请日 2022.04.08 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 马小媛　李晨彪　陈沛芳　王周平　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 专利代理师 杨慧林 (51)Int.Cl. C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) G01N 33/533(2006.01) G01N 33/58(2006.01) G01N 33/53(2006.01)G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观 察P53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用 (57)摘要 本发明公开了核酸多色荧光探针及制备与 在实时原位观察P53介导的细胞凋亡通路顺序激 活中的应用。 在S ‑AuNSs@SiO2表面通过酰胺键修 饰P53固定链、 Bax固定链以及Cyt  c固定链， 通过 互补配对准则连接上修饰有不同荧光基团的互 补链、 适配体链， 构建多色荧光探针。 在靶 标存在 下， DNA双链 被迫解开， 荧光团从体系中释放出来 使猝灭的荧光恢复。 由于具有20个对称 “热点”， 可产生更强的局部电场， 基于S ‑AuNSs的探针表 现出更好的光学性能。 本发明 的S‑AuNSs@SiO2‑P 集成度高， 易于获取， 实现了活细胞中实时原位 观察P53介导的凋亡通路的顺序激活， 在机理研 究、 药物发现、 凋亡过程动态监测等具有应用前 景。 权利要求书2页 说明书9页 附图11页 CN 114854823 A 2022.08.05 CN 114854823 A 1.一种核酸多色荧光探针S ‑AuNSs@SiO2‑P， 其特征在于， 包 括由二氧化硅包覆的对称金 纳米星、 靶标固定链和靶标识别链； 其中， 所述二氧化硅包覆的对称金纳米星的直径为260～300nm； 所述靶标固定链选自 P53固定链、 Bax固定链和Cyt  c固定链中的一种或多种； 所述靶标识别链选自P53识别链、 Bax识别链和C yt c适体链中的一种或多种； 所述靶标固定链和靶标识别链 通过碱基互补配 对进行连接； 所述P53固定链、 B ax固定链或Cyt  c固定链标记有羧基基团， 所述P53识别链、 B ax识别 链或Cyt c适体链标记有不同的荧 光基团。 2.根据权利要求1所述的核酸多色荧光探针S ‑AuNSs@SiO2‑P， 其特征在于， 所述不同的 荧光基团选自FAM、 TAMRA和Cy5中的一种或多种。 3.根据权利要求1所述的核酸多色荧光探针S ‑AuNSs@Si O2‑P， 其特征在于， 所述P53固定 链序列： 5 ’ ‑COOH‑AAAAAGCTTTGAGGTGC‑3’； Bax固定链： 5 ’ ‑COOH‑AAAAAAGAGGCGGGGG‑3’； Cyt c固定链： 5 ’ ‑COOH‑AAAAAGCAACAACGTAC‑3’； P53识别链： 5 ’ ‑GCACAAACACGCAC CTCAAAGC‑荧光基团‑3’； Bax识别链： 5 ’ ‑CTCAGAGCTG GTGGGCCCCCCGCCTCT‑荧光基团‑3’； Cyt c适体链： 5 ’ ‑CCGTGTCTG GGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC‑荧光基团‑3’。 4.根据权利要求1所述的核酸多色荧光探针S ‑AuNSs@SiO2‑P， 其特征在于， 所述二氧化 硅包覆的对称金纳米星通过以下 方法制备 得到： S1： 将PVP溶液加热至回流， 加入HAuCl4·3H2O的DEG溶液并反应， 反应结束， 清洗并固液 分离取固相， 并将固相分散 于有机溶剂中， 得到I ‑AuNPs溶液； S2： 向PVP溶液中加入DMA溶液和盐酸溶液搅拌混合均匀， 加入S1中所得I ‑AuNPs溶液， 然后加入HAuCl4溶液， 加热反应得到对称金纳米星； S3： 将CTAC加入S2中所得对称金纳米星的水溶液并搅拌， 加入N aOH溶液， 并将TEOS至少 分三次加入， 反应得到所述 二氧化硅包覆的对称金纳米星。 5.如权利要求1 ‑4中任一项所述的核 酸多色荧光探针S ‑AuNSs@SiO2‑P的制备方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将二氧化硅包覆 的对称金纳米星进行氨基化， 得到所述氨基官能化的二氧化硅包 覆的对称金纳米星S ‑AuNSs@SiO2； (2)取靶标固定链， 并加入EDC和NHS并孵育， 加入氨基官能化的二氧化硅包覆的对称金 纳米星进行反应， 得到 cDNA修饰的S ‑AuNSs@SiO2； (3)将靶标识别链与步骤(2)所得cDNA修饰的S ‑AuNSs@SiO2混合孵育， 得到所述核酸多 色荧光探针S‑AuNSs@SiO2‑P。 6.如权利要求1 ‑4中任一项所述的核酸多色荧光探针S ‑AuNSs@SiO2‑P在定量或定性检 测P53 mRNA、 BaxmRNA或Cyt  c中的应用。 7.如权利要求1 ‑5中任一项所述的核酸多色荧光探针S ‑AuNSs@SiO2‑P在检测活细胞中 实时原位 监测P53介导的细胞凋亡通路的应用。 8.根据权利要 求7所述的应用， 其特征在于， 检测方法： 将含有S ‑AuNSs@SiO2‑P的培养基 用于孵育细胞， 然后加入 含有毒素的培 养基进行孵 育， 荧光成像采集数据。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114854823 A 29.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述细胞包括人宫颈癌细胞Hela、 人结直 肠腺癌细胞Caco ‑2、 人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞中的一种或多种。 10.根据权利 要求7所述的应用， 其特征在于， 所述毒素选自T ‑2毒素、 黄曲霉毒素B1、 呕 吐毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素中的一种或多种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114854823 A 3