(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210368664.8 (22)申请日 2022.04.08 (71)申请人 漳州傲农现代农业 开发有限公司 地址 363200 福建省漳州市漳浦县赤岭畲 族乡石坑村九坵工区 申请人 泰和县傲牧 育种有限公司 　 金华市宏业畜牧 养殖有限公司 　 福建傲农生物科技 集团股份有限公 司 (72)发明人 张蓉　毛旭明　沈俊杰　凌勇　 丁能水　万文峰　龙毅　施建军　 吴有林　 (74)专利代理 机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 312 25 专利代理师 褚明伟(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种猪蓝 耳类NADC30毒株的荧光探针引物、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及生物学分子技术领域， 尤其是涉 及一种猪蓝 耳类NADC30毒株的荧光探针引物、 试 剂盒及其应用。 本发明选 择NADC30 ‑like、 Jxa  1、 GM2、 XHGD基因组的保守序列之间同源性较低的 序列设计探针引物， 本发明试剂盒可以同时进行 大批量的样 本分析， 一次检测即可鉴别样本中是 否有类NADC30毒株， 且本发明提供一种猪源型内 参， 能够满足检测猪源样品时内控核酸检测的要 求， 避免假阴性结果， 具有简便快捷、 稳定性好、 灵敏度高、 特异性强的特点。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 114717361 A 2022.07.08 CN 114717361 A 1.一种猪蓝耳类NADC 30毒株的引物探针组， 其特 征在于， 所述引物探针组包括： 上游引物NADC 30‑F： 5’ ‑TCCGGAGAACAGGCCTCTT‑3’； 下游引物NADC 30‑R： 5’ ‑ACCGCACCCGGACTTGATCT‑3’； 荧光探针引物NADC30 ‑P： 5’ ‑CTGCCCCACGCAAG ‑3’， 其中5’端添加报告基团FAM， 3 ’端添 加淬灭基团MGB。 2.根据权利 要求1所述的一种猪蓝耳类NADC30毒株的引物探针组， 其特征在于， 还包括 猪源型内参的引物探针组， 所述引物探针组包括： 上游引物acti n‑F： 5’ ‑TGACGGAGCGGGGCTACAG‑3’； 下游引物acti n‑R： 5’ ‑ATCGTGCG GGACATCAAGGAGAAGC‑3’； 荧光探针引物actin ‑P： 5’ ‑TCGTTGCCGATGGTGATGA ‑3’， 其中5’端添加报告基团HEX， 3 ’ 端添加淬灭基团BHQ1。 3.一种试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括阴性对照、 阳性对照、 引物预混液、 探针预 混液、 PCR扩增液、 酶预混液； 所述引物预混液包括 NADC30‑F、 NADC30‑R、 actin‑F和actin‑R， NADC30‑F： 5’ ‑TCCGGAGAACAGGCCTCTT‑3’， NADC30‑R： 5’ ‑ACCGCACCCGGACTTGATCT‑3’， actin‑F： 5’ ‑TGACGGAGCGGGGCTACAG‑3’， actin‑R： 5’ ‑ATCGTGCG GGACATCAAGGAGAAGC‑3’； 所述探针预混液包括 NADC30‑P和actin‑P， NADC30‑P： 5’ ‑CTGCCCCACGCAAG ‑3’， 其中5’端添加报告基团FAM， 3 ’端添加淬灭基团 MGB， actin‑P： 5’ ‑TCGTTGCCGATGGTGATGA ‑3’， 其中5’端添加报告基团HEX， 3 ’端添加淬灭基 团BHQ1。 4.根据权利 要求3所述的一种试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照为含有类NADC30毒株 和猪源内参基因β ‑actin基因片段的重组质粒； 所述阴性对照为双蒸水； 所述PCR扩增液为 南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2 ×One Step U+； 所述酶预混液为 南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的One  Step U+Enzyme Mix。 5.一种如权利要求3所述的试剂盒的应用， 其特 征在于， 所述应用具体包括以下步骤： (1)提取待测样品的总RNA； (2)以步骤(1)中得到的总RNA为模板， 利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作 为实验组； 以阴性对照为模板， 利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阴性对照 组； 以阳性对照为模板， 利用试剂盒配置荧 光反应体系进行荧 光扩增作为阳性对照组； (3)根据步骤(2)的荧光扩增反应结果判定待测样品为蓝耳类NADC30病毒和/或猪源性 内参核酸阳性或阴性。 6.根据权利要求5所述的一种试剂盒的应用， 其特征在于， 步骤(2)中， 以荧光反应体系 总体积为30 μL计， 实验组包括总RNA  6 μL， 引物预混液2.4 μL， 探针预混液0.6 μL， PCR扩增液 15 μL， 酶预混液1.5 μL， d dH2O 4.5 μL； 阴性对照组包括引物预混液2.4μL， 探针预混液0.6μL， PCR扩增液15μL， 酶预混液1.5μ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717361 A 2L， ddH2O 10.5 μL； 阳性对照组包括含有类NADC30毒株和猪源内参基因β ‑actin基因片段的重组质粒6 μL， 引物预混液2.4 μL， 探针预混液0.6 μL， PCR扩增液15 μL， 酶预混液1.5 μL， d dH2O 4.5 μL。 7.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用， 其特征在于， 引物预混液中， NADC30 ‑F、 NADC30‑R、 actin‑F和actin‑R的摩尔比为1： 1： 1： 1。 8.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用， 其特征在于， 探针预混液中， NADC30 ‑P和 actin‑P的摩尔比为1： 1。 9.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述荧光扩增的 反应程序具体为： 5 5℃15min， 95℃30s， 循环为95℃10s， 6 0℃30s， 共计45个 循环。 10.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用， 其特征在于， 步骤(3)中， 结果判定： 取待 测样本与权利要求1所述的猪蓝耳类NADC30毒株的引物探针组混合进行反应， 根据荧光信 号进行待测样本的结果判定 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717361 A 3