(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210383726.2 (22)申请日 2022.04.11 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： V202083 2020.12.10 CCTCC NO： V201945 2019.07.09 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市孝陵卫钟灵街 50号 (72)发明人 钱晶　汤正旭　刘雪　 (74)专利代理 机构 长春众邦菁华知识产权代理 有限公司 2 2214 专利代理师 于晓庆 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于检测鸽副黏病毒的RT-PCR引物及其应 用和含有该引物的RT-PCR试剂盒 (57)摘要 用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR引物及其应 用和含有该引物的RT ‑PCR试剂盒， 属于动物病原 微生物检测领域， 本发明的用于检测鸽副黏病毒 的RT‑PCR引物， 其序列分别为SEQ  ID NO:1和SEQ   ID NO:2， 以该RT ‑PCR引物建立的RT ‑PCR试剂盒 和RT‑PCR检测方法具有较强的特异性、 灵敏性和 重复性， 能够准确鉴定鸽副黏病毒， 解决了现有 用于检测鸽副黏病毒的引物存在的结合特异性 低、 扩增出现假阴性的问题。 本发明通过该RT ‑ PCR引物所建立的RT ‑PCR试剂盒和RT ‑PCR检测方 法具有简便、 特异、 灵敏的优点， 可替代传统的病 原学检测方法， 对于保障养 鸽业的持续健康发展 具有重要现实意 义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 CN 114717231 A 2022.07.08 CN 114717231 A 1.用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR引物， 其特 征在于， 该RT ‑PCR引物序列信息如下： 正向引物PVI4503‑F： 5’ ‑CACGGGTAGAAGAGTCTG G‑3’； 反向引物PVI5019‑R： 5’ ‑CTCTCCTTAAGCCGGAGGAT‑3’。 2.根据权利 要求1所述的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR引物， 其特征在于， 所述正向引 物能与鸽副黏病毒基因组第4503位～第4521位结合， 所述反向引物能与鸽副黏病毒基因组 第5000位～第5 019位结合。 3.如权利要求1所述的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR引物在制备用于检测鸽副黏病毒 的试剂中的应用。 4.用于检测 鸽副黏病毒的RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包括： RT ‑PCR反应液、 阳性质控品和阴性质控品； 所述RT ‑PCR反应液中含有正向引物PVI4503‑F和反向引物PVI5019‑R； 正向引物PVI4503‑F： 5’ ‑CACGGGTAGAAGAGTCTG G‑3’； 反向引物PVI5019‑R： 5’ ‑CTCTCCTTAAGCCGGAGGAT‑3’。 5.根据权利 要求4所述的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 所述正向 引物PVI4503‑F和反向引物PVI5019‑R的浓度均为20 μmo l/L， 用量均为1 μL。 6.根据权利要求4所述的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 所述RT ‑ PCR反应液还包括： PrimeScript  1Step Enzyme Mix、 Step  Buffer(2 ×)和蒸馏水； 所述 PrimeScript  1Step Enzyme Mix用量为2 μL； 所述Step  Buffer(2×)用量为25 μL。 7.根据权利 要求4所述的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 所述阳性 质控品为阳性标准品p19T+P PMV517bp。 8.根据权利 要求4所述的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR试剂盒， 其特征在于， 所述阴性 质控品为DEPC水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717231 A 2用于检测鸽副黏病毒 的RT‑PCR引物及其应用和含有该引物的 RT‑PCR试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于动物病原微生物检测技术领域， 具体涉及一种用于检测鸽副黏  病毒 的RT‑PCR引物及其应用和含有该引物的RT ‑PCR试剂盒。 背景技术 [0002]PPMV‑1为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒I型病毒， 因此也称为鸽源新  城疫 病毒(NDV)， 基因组为不 分节段的单股负链RNA， 基因组结构 模式为 3’ ‑NP‑P‑M‑F‑HN‑L‑5’， 依次编码六种结构蛋白： 核衣壳蛋白(NP)、 磷蛋白(P)、  基质蛋白(M)、 融合蛋白(F)、 血凝 素‑神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白  (L)。 NDV仍只一个血清型， 但 根据F基因高变区的遗 传进化分析可将所有毒株  分为Class Ⅰ和ClassⅡ大类， 其中Class Ⅱ又可分为至少 20个基 因型。 分子流行病  学研究结果表明， 目前在我国鸽群中流行的NDV以Class Ⅱ中的基因V I型 为主。 [0003] [0004]目前， 鸽副黏病毒病的诊断， 通常是观察鸽群是否出现典型的神经症状和  黄绿色 水样腹泻等临床表现， 但此时鸽群副黏病毒病一旦爆发， 已很难挽救。  鸽群在未出现病征 之前， 采用病原学诊断方法(如RT ‑PCR检测方法)开展鸽群  的早期检测与监测， 能有助于筛 查病原和及时预防， 将损失降到最低。 然而，  采用中华人民共和国国家标准 《GB/T16550 ‑ 2020新城疫诊断技术》 (发布日：  2020‑12‑14， 实施日： 2020 ‑12‑14， 发布机构： 国家市场 监 督管理局、 国  家标准化管理委员会)中的反转录聚合酶链 式反应(RT ‑PCR)引物(正 向引物  P1： 5’ ‑ATGGGCYCCA GAYCTTCTAC ‑3’， 反向引物P2： 5 ’ ‑CTGCCACTGCT  AGTTGTGATAATCC ‑3’)经 常无法有效扩增 到条带， 致使出现假阴性现象(即  本应该是阳性结果， 却是阴性结果)。 究 其原因， 上述国家标准中的RT ‑PCR引 物只能结合部分Class Ⅱ类中的基因VI型NDV基因组 序列， 随着NDV不断变  异， 尤其是基因VI型NDV的F基因变异频率最高， 其序列也在发生突 变， 使 得与国家标准中的RT ‑PCR引物的结合特异 性越来越低， 导致出现引物 不特异、 扩增 假阴性的现象。 [0005]因此， 设计和筛选针对性强、 特异性高的鸽副黏病毒RT ‑PCR检测引物对于  优化和 提高鸽副黏病毒RT ‑PCR检测方法的准确性 起到关键性作用。 发明内容 [0006]为了解决现有用于检测 鸽副黏病毒的引 物存在的结合特异性低、 扩增出现  假阴 性的问题， 本发明提供一种用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR引物及其应用和  含有该引物的 RT‑PCR试剂盒。 [0007]本发明为 解决技术问题所采用的技 术方案如下： [0008]本发明的用于检测鸽副黏病毒的RT ‑PCR引物， 该RT ‑PCR引物序列信息如  下： [0009]正向引物PVI4503‑F： 5’ ‑CACGGGTAGAAGAGTCTG G‑3’；说　明　书 1/5 页 3 CN 114717231 A 3