(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210376566.9 (22)申请日 2022.04.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114438200 A (43)申请公布日 2022.05.06 (73)专利权人 北京和合医学诊断技 术股份有限 公司 地址 101111 北京市大兴区经济技 术开发 区经海六路5号 东尚E园14 号楼 (72)发明人 贾永娟　周坤　刘春冉　倪君君　 (74)专利代理 机构 北京开阳星知识产权代理有 限公司 1 1710 专利代理师 董亚男 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 110684765 A,2020.01.14 US 20102 27776 A1,2010.09.09 CN 112522376 A,2021.0 3.19 CN 10471 1344 A,2015.0 6.17 WO 2004059013 A1,20 04.07.15 彭娟.基因多态性对中国汉 族机械瓣膜置换 术后患者 华法林稳态剂量的影响. 《中国优秀硕 士学位论文全文数据库》 .2015,(第3期),E 079- 182. 审查员 毛颖 (54)发明名称 维生素K代谢相关基因的分型试剂盒、 引物 和分型方法 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 具体讲， 涉 及一种维生素K代谢相关基因的分型试剂盒、 引 物和分型方法。 分型试剂盒至少包括核酸扩增试 剂和单碱基延伸反应试剂； 核酸扩增试剂中含有 如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:22所示的PCR扩增引 物； 单碱基延伸反应 试剂中含有如SEQ  ID NO:23 ~SEQ ID NO:43所示的单碱基延伸引 物。 分型方 法包括： PCR扩增引物进行PCR扩增反应、 碱性磷 酸酶消化、 单碱基延伸引物进行单碱基延伸反 应、 脱盐处理、 高效液相色谱 ‑质谱联用检测。 本 发明试剂盒和检测方法可提高维生素K代谢相关 基因的分型检测效率、 简便易行、 准确性高、 自动 化程度高。 权利要求书2页 说明书24页 序列表9页 CN 114438200 B 2022.06.14 CN 114438200 B 1.一种维生素K代谢相关基因的分型试剂 盒， 其特征在于， 所述分型试剂 盒至少包括核 酸扩增试剂和单碱基延伸反应试剂； 所述核酸扩增试剂中含有如SEQ  ID NO:1~ SEQ ID NO:22所示的PCR扩增引物； 所述单碱基延伸反应试剂中含有如SEQ  ID NO:23~ SEQ ID NO:43所示的单碱基延伸 引物。 2.根据权利要求1所述的分型试剂 盒， 其特征在于， 所述分型试剂 盒中还包括碱性磷酸 酶反应液和/或脱盐试剂； 所述碱性磷酸酶反应液中的碱性磷酸酶选自虾碱性磷酸酶、 小牛肠碱性磷酸酶、 大肠 杆菌碱性磷酸酶、 大鼠碱性磷酸酶中的至少一种； 所述碱性磷酸酶的浓度为1.7  U/µL； 所述脱盐试剂选自脱盐树脂 。 3.根据权利要求1所述的分型试剂 盒， 其特征在于， 所述分型试剂 盒中还包括纯合突变 阳性对照品、 阴性对照品和杂合 突变阳性对照品； 所述纯合 突变阳性对照品为核苷酸序列如SEQ  ID NO: 46所示的DNA片段； 所述阴性对照品为野生型DNA片段核苷酸序列如SEQ  ID NO: 47所示的DNA片段； 所述杂合 突变阳性对照品： SEQ  ID NO:46和SEQ  ID NO:47的摩尔比为1： 1的混合物。 4.根据权利要求1所述的分型 试剂盒， 其特 征在于， 所述核酸扩增试剂包括A1管和 B1管： A1管 中含有如SEQ  ID NO:3 ~ SEQ ID NO:18所示 的PCR扩增引物， B1管中含有如SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2、 SEQ ID NO:19 ~ SEQ ID NO:22 所示的PCR扩增引物； A1管采用Agena酶系的DNA聚合酶， B1管采用FastStar t酶系的DNA聚合酶； 所述核酸扩增试剂还包含C1管和D1管， C1管和D1管中分别含有如SEQ  ID NO:44、 SEQ   ID NO:45所示的参 考引物； 在A1管中， 如SEQ  ID NO:3 ~ SEQ ID NO:18所示引物的浓度均为0.3  ~ 0.8µmol/L； 在 B1管中， 如SEQ  ID NO:1、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:19 ~ SEQ ID NO:22所示引物的浓度0.3   ~ 0.8µmol/L； 在C1管和D1管中SEQ  ID NO:44、 SEQ  ID NO:45所示引物的浓度均为0.3  ~  0.8µmol/L； 所述单碱基延伸反应试剂包括A2管、 B2管、 C2管和D2管： A2管和C2管中均含有如SEQ  ID  NO:25 ~ SEQ ID NO:41所示的单碱基延伸引物， B 2管和D2管中均含有如SEQ  ID NO:23、 SEQ  ID NO:24、 SEQ  ID NO:42、 SEQ  ID NO:43所示的单碱基延伸引物； 在A2管和C2管中， 如SEQ  ID NO:25、 SEQ  ID NO:28、 SEQ  ID NO:31、 SEQ  ID NO:41所示 引物的浓度均为8  ~ 20µmol/L； 如SEQ  ID NO:26、 SEQ  ID NO:29、 SEQ  ID NO:32、 SEQ  ID  NO:35~37、 SEQ ID NO:39所示引物的浓度均为10  ~ 15µmol/L； 如SEQ  ID NO:27、 SEQ  ID  NO:30、 SEQ  ID NO:33、 SEQ  ID NO:34、 SEQ  ID NO:38、 SEQ  ID NO:40所示引物的浓度均为15   ~ 20  µmol/L； 在B2管和D2管中， 如SEQ  ID NO:23、 SEQ  ID NO:43所示引物的浓度均为8  ~  12  µmol/L， 如SEQ  ID NO:24、 SEQ  ID NO:42所示引物的浓度均为10  ~ 15  µmol/L。 5.一种维生素K代谢相关基因分型的引物， 其特征在于， 所述引物为如SEQ  ID NO:1~  SEQ ID NO:22所示核苷酸序列； 所述引物还 包括如SEQ  ID NO:44、 SEQ ID NO:45所示的参 考引物对。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438200 B 26.一种非诊断目的的维生素K代谢相关基因的分型方法， 其特征在于， 至少包括以下步 骤： S1、 利用如SEQ  ID NO:1~ SEQ ID NO:22所示的PCR扩增引物进行PCR扩增反应， 获得特 异性扩增产物； S2、 利用碱性磷酸酶消化， 去除所述特异性扩增产物中的dNTP， 获得消化后产物； S3、 利用SEQ  ID NO:23 ~ SEQ ID NO:43所示的单碱基延伸引物对所述消 化后产物进 行单碱基延伸反应， 获得延伸反应产物； S4、 对所述延伸反应产物进行脱盐处 理， 获得脱盐产物； S5、 通过高效液相色谱 ‑质谱联用对所述脱盐产物进行检测， 分析后获得维生素K代谢 相关基因的分型 结果。 7.根据权利要求6所述的分型 方法， 其特 征在于， 所述PCR扩增反应的程序为： 90  ~ 98℃预变性、 30秒~10分钟； 90  ~ 95℃变性、 10秒~1 分钟， 50 ~ 60℃退火、 10秒~1分钟， 68  ~ 72℃延伸、 30秒~10分钟， 扩增25  ~ 45个循环； 68   ~ 72℃后延伸， 5分钟； 所述消化的条件为： 30  ~ 40℃消化处理10  ~ 60分钟， 70  ~ 85℃加热变性5  ~ 30分 钟， 2 ~ 8℃终止； 所述单碱基延伸反应的程序为： 90  ~ 98℃热启动， 30秒~10分钟； 90  ~ 98 ℃变性， 5秒； 50  ~ 58℃退火、 5秒， 65  ~ 85℃延伸、 5秒， 扩增40个循环； 68  ~ 75℃终延伸， 1   ~ 10分钟。 8.根据权利要求6所述的分型 方法， 其特 征在于， 在S5中， 所述高效液相色谱中： 流动相： A相为含有六氟异丙醇和三乙胺的水； 六氟异丙醇的体积百分比为0.4  ~  0.6%， 三乙胺的体积百分比0.1  ~ 0.12%； B相为含有六氟异丙醇和三乙胺的甲醇； 六氟异丙醇的体积百分比为0.4~ 0.6%， 三乙 胺的体积百分比0.1  ~ 0.12%。 9.根据权利要求6或8所述的分型方法， 其特征在于， 在S5中， 所述高效液相色谱中： 色 谱梯度为： 0 ~ 1 min， 5％~20％B； 1 ~ 3.5 min， 20％~ 40％B； 3.5  ~ 5.5 min， 40％~95％ B； 5.5 ~ 6 min， 95％~ 5％B； 6 ~ 10 min， 5％B； 流速为0.2  mL/min； 色谱柱选用DNAPac分析柱， 2.1 ×100 mm， 柱温为： 6 0℃； 上样量为10 μL。 10.根据权利要求6所述的分型方法， 其特征在于， 在S5中， 所述质谱的条件为： 鞘气35   Arb； 辅气10  Arb； 喷雾电压 3400 V； 离子传输管温度320