(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210380641.9 (22)申请日 2022.04.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114807068 A (43)申请公布日 2022.07.29 (66)本国优先权数据 202110412610.2 2021.04.16 CN (73)专利权人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 张青林　张萌　徐莉清　郭大勇　 罗正荣　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/08(2018.01) A01H 6/00(2018.01) (56)对比文件 CN 1027325 36 A,2012.10.17 CN 112143743 B,2020.12.2 9 CN 103952416 A,2014.07.3 0 WO 2019040412 A1,2019.02.28 张萌等.MicroRNA143 c介导中国甜柿自然 脱 涩的功能研究. 《中国园艺学会2019年学术 年会 暨成立90周年纪念大会论文摘要集》 .2019, Q.Zhang等.Advance o n deastri ngency mechanism in Chinese PCNA persim mon. 《ISHS》 .202 2, 审查员 全弘扬 (54)发明名称 一种乙醛脱氢酶基因DkALDH10及其应用 (57)摘要 本 发 明 公 开 了 一 种乙 醛 脱 氢 酶 基因 DkALDH10及其应用， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO: 2所示。 本发明通过对中国甜柿 ‘鄂柿1号’果实发 育的关键时期的果肉转录组数据进行表达差异 筛选， 首次克隆并鉴定到了一个中国甜柿乙醛脱 氢酶基因家族重要成员DkALDH10基因。 进一步， 通过构建DkALDH10基因干 涉载体和超表达 载体， 以及遗传转化验证DkALDH10基因通过调控乙醛 代谢而调节果实可溶性单宁和不溶性单宁的相 对含量， 进而调节柿脱涩过程。 本发明首次阐明 了DkALDH10基因与中国甜柿自然脱涩间的关系， 完善了中国甜柿自然脱涩分子调控网络， 为中国 甜柿遗传改良提供了新的科 学依据和基因资源。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图5页 CN 114807068 B 2022.12.27 CN 114807068 B 1.一种乙醛脱氢酶DkALDH10， 其特征在于， 所述乙醛脱氢酶DkALDH10 的氨基酸序列如 SEQ ID NO： 1所示， 所述乙醛脱氢酶DkALDH10 定位于细胞质膜和液泡膜中。 2.一种编码权利要求1所述的乙醛脱氢酶DkALDH10的基因， 其特征在于， 所述基因为 DkALDH10 基因， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示。 3.一种用于扩增如权利 要求2中所述的 DkALDH10 基因的扩增引物， 其特征在于， 所述扩 增引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3‑4所示。 4.一种用于检测如权利 要求2中所述的 DkALDH10 基因的荧光定量PCR特异引物， 其特征 在于， 所述 荧光定量PCR特异引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5‑6所示。 5.一种载体， 其特 征在于， 所述载体中包 含如权利要求2中所述的 DkALDH10 基因。 6.根据权利 要求5所述的载体， 其特征在于， 所述载体为 DkALDH10 基因的超表达载体或 干涉表达载体。 7.一种遗传工程菌， 其特 征在于， 所述遗传工程菌中包 含如权利要求5所述的载体。 8.如权利 要求2所述的 DkALDH10 基因， 或如权利 要求5所述的载体， 或如权利 要求7所述 的遗传工程菌在调节柿 脱涩中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 如权利 要求2所述的 DkALDH10 基因， 或如权 利要求5所述的载体， 或如权利要求7所述的遗传工程菌通过调节可溶性单宁和不溶性单宁 的含量， 进 而调节柿 脱涩。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807068 B 2一种乙醛脱 氢酶基因DkAL DH10及其应用 技术领域 [0001]本发明属于植物基因工程技术领域， 具体涉及一种乙醛脱氢酶基因  DkALDH10及 其应用。 背景技术 [0002]我国是柿(Diospyros  kaki Thunb.)原产地， 也是世界上柿树栽培历史最悠久、 面 积最大和产量最多的国家， 但传统产区以涩柿为主。 柿果中存在特化的单宁细胞， 其液胞中 积累的原花青素(又称 “单宁”， proanthocyanidin,PA)是食用后产生涩感的主要原因。 根据 果实成熟时能否在树上自然脱涩及其性状遗传特点， 现有柿品种分为完全甜柿 (Pollination ‑constant &non‑astringent， PCNA； 简称 “甜柿”)和非完全 甜柿(non ‑PCNA； 简 称“涩柿”)。 涩柿果实成熟后需经脱涩处理才能食用， 不仅消耗人力、 物力和财力， 且脱涩后 的果实货架期短； 而脱涩不完全的柿果不仅商品性降低， 还引起消费者对其诱发胃柿石 (gastric phytobezoar)的恐惧。 因此， 成熟果实可在树上自然脱涩的完全甜柿是目前世界 范围内产业发展和遗传改良的重点目标。 [0003]已有研究表明， 中国甜柿自然脱涩是乙醛介导的可溶性单宁 的不溶化过程， 亦即 果实中的挥发性产物乙醛与可溶性单宁结合转变生成不导致涩感的不溶性凝胶类物质(通 称“凝固效应 ”)， 该过程主要受乙醛代谢途径中的三个酶基因家族控制： 丙酮酸脱羧酶 (pyruvate  decarboxyl ase,PDC)， 乙醇脱氢酶(alcohol dehydro genase,ADH)和醛脱氢酶 (aldehyde dehydrogenases,ALDH)。 其中， 乙醛脱氢酶(ALDH)催化乙醛氧化形成乙酸、 CO2 和H2O。 已有研究结果表明， 利用乙醇和CO2等处理均显著增强ADH和PDC的活性， 诱导果实乙 醛含量升高， 促进可 溶性单宁向不溶性单宁的转 化， 最终导 致果实脱涩。 [0004]柿遗传背景复杂， 染色体倍性高， 尤其是基因组信息和甜涩性状遗传规律的研究 相对滞后。 乙醛脱氢酶及其相关基因在木本植物中研究较少 。 此外， 柿单宁单体的种类、 胞 质运输与跨膜转运的选择性， 以及在液泡中的聚合方式等导致中国甜柿和日本甜柿具有不 同的自然脱涩机理。 其中， 乙醛代谢的下游关键基因DkALDH在中国甜柿自然脱涩中的效应 尚无直接相关证据， 还 鲜有 DkALDH的基因功能被验证。 发明内容 [0005]本发明针对现有技术的空白点， 根据 中国甜柿‘鄂柿1号’果实发育的关键时期的 果肉转录组数据进行表达差异筛选， 克隆鉴定到了一个差异表达基因即乙醛脱氢酶基因 DkALDH10， 并首次验证其与中国甜柿自然脱涩之间的关系， 完善了中国甜柿自然脱涩分子 调控网络， 为进一 步的遗传改良调节柿 脱涩提供了新的科 学依据和基因资源。 [0006]本发明的目的之一在于提供一种乙醛脱氢酶DkALDH10， 所述乙醛脱氢酶   DkALDH10的氨基酸序列如SEQ  ID NO： 1所示。 [0007]进一步的， 所述乙醛脱氢酶DkALDH10 定位于细胞质膜和液泡膜中。 [0008]本发明的目的之二在于提供了一种编码上述乙醛脱氢酶D kALDH10的基因， 所述基说　明　书 1/6 页 3 CN 114807068 B 3