(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210379080.0 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 江西农业大 学 地址 330045 江西省南昌市 市辖区经济开 发区志敏大道1 101号 (72)发明人 廖光联　徐小彪　黄春辉　钟敏　 曲雪艳　贾东峰　刘青　 (74)专利代理 机构 江西省专利事务所 3 6100 专利代理师 殷勇刚 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6811(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于毛花猕猴桃赣猕6号品种鉴定的分 子标记引物及开发和应用方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于毛花猕猴桃 “赣猕6 号”品种鉴定的分子标记引物， 所述分子标记命 名为EST‑Ad42， EST‑Ad42分子 标记包括分子标记 引物EST‑Ad42‑F和分子标记引物 EST‑Ad42‑R， 所 述 分 子 标 记 引 物 E S T ‑A d 4 2‑F 结 构 为 gttaatttgatcgggatgg， 所述分子标记引物EST ‑ Ad42‑R结构为gaggagcttgagctgctat， 退火温度 为62℃。 本发明要解决的另一个问题是于提供一 种用于毛花猕猴桃 “赣猕6号”品种鉴定的分子标 记引物的开发方法和应用方法。 本发 明分子标记 引物特异性高， 利用分子标记EST ‑Ad42引物对 DNA进行扩增， 构建特异性的DNA分子身份 证。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 CN 114807415 A 2022.07.29 CN 114807415 A 1.一种用于毛花猕猴桃 “赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物， 其特征在于， 所述分子标 记命名为EST ‑Ad42， EST ‑Ad42分子标记包括两个引物， 分别为分子标记引物EST ‑Ad42‑F和 分子标记引物ES T‑Ad42‑R， 所述分子标记引物ES T‑Ad42‑F结构为gttaatttgat cgggatgg， 所 述分子标记引物EST ‑Ad42‑R结构为g aggagcttgagctgctat， 退火温度为62℃。 2.一种权利要求1所述分子标记引物的开发方法， 其 步骤包括， （1） 从NCBI  db EST数据库下载所有的猕猴桃EST序列， 并利用SSR  Hunter1.3软件， 对 所有下载的EST序列进行S SR筛查； （2） SSR筛查的标准是： 二核苷酸、 三核苷酸、 四核苷酸、 五核苷酸和六核苷酸， 最少重 复 次数分别为7次、 5次、 4次、 4次、 3次， 获得中间序列； （3） 应用Primer  5.0软件设计猕猴桃EST ‑SSR引物； （4） 利用设计合成的引物， 对毛花猕猴桃 “赣猕6号”品种进行PCR扩增， 筛选得到分子标 记EST‑Ad42， EST ‑Ad42分子标记包括两个引物， 分别为分子标记引物EST ‑Ad42‑F和分子标 记引物ES T‑Ad42‑R， 所述分子标记引物ES T‑Ad42‑F结构为gttaatttgat cgggatgg， 所述分子 标记引物EST ‑Ad42‑R结构为g aggagcttgagctgctat， 退火温度为62℃。 3.如权利要求2所述开发方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 猕猴桃EST ‑SSR引物的设计方 法为， 选取步骤 （2） 获得的中间序列200 ‑300bp， 输入Primer  5.0软件进行设计， 设计参数 为： 引物序列2 2±2bp， 产物大小15 0‑200bp， 引物GC含量 40‑55%， 退火温度5 0‑65℃。 4.一种权利要求1所述分子标记引物的应用方法， 其特 征在于， 利用权利要求1所述分子标记引物EST ‑Ad42‑F和分子标记引物EST ‑Ad42‑R对“赣猕6 号”及“华特”、“赣绿1号”、“赣绿2号”等已报道品种的DNA进行扩增， 使用8  w/v%丙烯酰胺凝 胶进行检测， 硝酸银染色显影， 凝胶图谱中的每一条带作为一个 分子标记， 每条多态性带可 视为一个等位基因， 根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位点的二元数据， 有带记 为“1”， 无带记为 “0”， 根据不同条带的大小和数 目绘制成1/0矩阵， 构建成特异性分子身份 证， 通过特异性分子身份 证鉴定“赣猕6号”。 5.如权利 要求4所述应用方法， 其特征在于， 通过特异性分子身份证， 对 “华特”、“赣绿1 号”、“赣绿2号”进行区分。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807415 A 2一种用于毛花 猕猴桃赣猕6号品种鉴定的分子标记引物及 开 发和应用方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域， 具体涉及用于毛花猕猴桃 “赣猕6 号”品种鉴定的分子标记引物。 本发明还涉及用于毛花猕猴桃 “赣猕6号”品种鉴定的分子标 记引物的开发和应用方法。 背景技术 [0002]猕猴桃是原产于中国的猕猴桃科猕猴桃属的特色浆果树， 果实营养密度较高， 花 色多样极具观赏性， 是鲜食与 观赏兼备的多年生落叶藤本果树。 目前， 全世界共有猕猴桃属 植物54个种及21个变种。 猕猴桃的鲜果富含抗坏血酸和氨基酸， 目前市场上主要以鲜食为 主， 也可加工成果脯、 果酒、 果汁等， 均具有独特的风味， 因此深受大众青睐。 毛花猕猴桃为 中国特有的猕猴桃属中的一个重要种类， 广泛分布于浙江、 福建、 江西、 湖南、 广西、 广东和 贵州等地， 是继中华猕猴桃和美味猕猴桃之后极具开发潜力的特色浆果， 野生种质资源十 分丰富。 由于毛花猕猴桃分布范围狭小、 均为二倍体、 基因保守等因素， 在外观形态上毛花 猕猴桃表现出一致性较高。 通过传统的观察树势、 叶片形态、 物候期、 果 实形状、 花器官颜色 等难以区分。 猕猴桃种植区的频繁引种， 更使得猕猴桃品种较混杂， 普遍存在同名异物和同 物异名现象。 [0003]利用分子标记技术鉴别品种已成为目前最为高效、 精准且不易受环境影响的一种 手段， 分子标记技术已在柑橘、 石榴、 葡萄、 桃上一些研究， 可以利用其进行亲缘关系分析、 种质鉴定等。 其中SSR分子标记技术应用最为广泛， 利用SSR进行分子身份证的构建已在许 多物种上取得了成功， 分子身份证构建不仅可以鉴别亲缘关系相 近的种质， 对于知识产权 的保护也是十分重要的手段。 [0004]“赣猕6号”系从野生毛花猕猴桃自然变异群体中选育而成的品种。 果实长圆柱形， 果面密被白色短茸毛。 果 实中大， 平均单果质量72.5g。 果肉墨绿， 可溶性固形物含量13.6%， 可滴定酸含量0.87%， 干物质含量为17.3%， 抗坏血酸含量7.23  mg/g， 果实成熟期为10月下 旬。 果实后熟达食用状态 时易剥皮， 肉质细嫩清香， 风味酸甜适度。 通过开发适用于毛花猕 猴桃“赣猕6号”的分子标记， 有利于从分子水平鉴定品种， 更有利于知识产权的保护。 发明内容 [0005]本发明的目的在于利用分子标记技术， 提供一种用于毛花猕猴桃 “赣猕6号”品种 鉴定的分子标记引物。 本发明的另外一个目的在于提供该分子标记引物在猕猴桃品种鉴定 中的开发和应用方法。 [0006]为了达到上述目的， 本发明采取以下技 术措施： 一种用于毛花猕猴桃 “赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物， 其特征在于， 所述分子 标记命名为EST ‑Ad42， EST ‑Ad42分子标记包括两个引物， 分别为分子标记引物EST ‑Ad42‑F 和分子标记引物 EST‑Ad42‑R， 所述分子标记引物ES T‑Ad42‑F结构为gttaatttgat cgggatgg，说　明　书 1/6 页 3 CN 114807415 A 3