(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210382445.5 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 珠海赛乐奇生物技 术股份有限公司 地址 519000 广东省珠海市唐家湾镇金峰 西路24号2栋4层 (72)发明人 宋家武　肖杰　王丽玲　胡荣　 (74)专利代理 机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 1 1246 专利代理师 李力 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种快速检测人乳头瘤病毒核酸型别的方 法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测人乳头瘤病毒 核酸型别的方法及试剂盒， 属于生物技术领域。 本发明提供的方法主要利用引物SEQ  ID NO.1‑2 以及探针SEQ  ID NO.5‑28实现对人乳头瘤病毒 不同型别的鉴定， 具体步骤为： (1)提取样本中的 DNA； (2)以步骤(1)提取的DNA为检测模板， 采用 RPA引物进行RPA扩增反应； (3)将扩增后的产物 分为若干份， 再分别加入不同的RPA探针进行杂 交； (4)分析RPA扩增产物 。 本发明采用RPA扩增技 术对目标片段进行扩增， 扩增后产物加到基因芯 片上进行杂交， 采用RPA扩增技术， 扩增时间只需 要20分钟就能达到目标基因的可检测浓度， 大大 缩短了检测时间。 权利要求书2页 说明书8页 序列表5页 附图3页 CN 114752706 A 2022.07.15 CN 114752706 A 1.一种人乳头瘤病毒型别鉴定的RPA引物和 RPA探针， 其特征在于， 所述引物包括上游 引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ  ID NO.2； 所述RPA探针如SEQ  ID NO.5‑28所示。 2.一种检测人乳头瘤病 毒型别的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1中的 RPA引物和RPA探针。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括RPA反应管、 阳性对照 模板、 阴性对照模板中的至少一种。 4.一种检测人乳 头瘤病毒型别的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取样本中的DNA； (2)以步骤(1)提取的DNA为检测模板， 采用权利要求1所述的RPA引物进行RPA扩增反 应； (3)将扩增后的产物分为若干份， 再分别加入不同的RPA探针进行杂交； (4)分析RPA扩增产物。 5.根据权利要求4所述的检测人乳头瘤病毒型别的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中 RPA扩增反应的体系为5 0 μL， 具体如下表所示： 体系组成 体积(uL) BufferA 20 BufferB 20 引物F(10umo l/ml) 2 引物R(10umo l/ml) 2 模板 2.5 Buffer C 2.5 最后使用d dH2O补足至50 μL； Buffer A包括20％PEG35000、 10％海藻糖、 250mM磷酸肌酸、 12.5mM二硫苏糖醇、 250mM   Tris‑HCl、 12.5mM  dNTPs和5mM  ATP； Buffer B为500ng  recA重组酶、 360ng单链结合蛋白、 25ng磷酸激酶、 150ng  BSU聚合酶 50ng M‑MLV逆转录酶和75ng大肠杆菌 外切酶Ⅲ； Buffer C为280mM醋酸镁溶 液。 6.根据权利要求5所述的检测人乳头瘤病毒型别的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中 RPA扩增反应的反应条件为37 ‑45℃下反应25 ‑35min。 7.根据权利要求4 ‑6中任一项所述的检测人乳头瘤病 毒型别的方法， 其特征在于， 所述 步骤(3)的具体操作为： 1)取10ul扩增产物至生物芯片检测区； 2)取100ul杂交缓冲液于芯片上， 在45℃反应30分钟； 所述杂交缓冲液为： 5 ×SSC缓冲 液， SDS浓度0.4％， TX ‑100浓度0.2％； 3)用预热的0.01 ‑0.1N NaOH溶液洗涤3次， 每次5 ‑10s； 4)将芯片置 于50℃0.1×SSC中洗涤1mi n， 空气吹干芯片表面； 5)取BW反应液100ul于芯片上， 室温反应10分钟； 所述BW反应液包括1 ×SSC和浓度 0.2mg/L为HRP的配 体； 6)用0.1×SSC溶液清洗3次， 每次1分钟， 空气吹干芯片表面；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752706 A 27)取100ul TMB显色液于芯片表面， 反应5分钟； 8)用0.1×SSC溶液清洗3次， 每次1分钟， 离心甩干芯片表面残余液体并拍照分析。 8.根据权利要求7所述的检测人乳头瘤病毒型别的方法， 其特征在于， 所述步骤(8)的 分析过程为： 每个HPV型别探针反应体系设置3个复点， 3个点是一样的， 其中3个点中至少2 个显示为阳性， 则认定分型检测结果有效。 9.权利要求1所述的RPA引物和RPA探针在制备 人乳头瘤病毒型别鉴定试剂中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752706 A 3