(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210399168.9 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 首都医科 大学附属北京口腔医院 地址 100050 北京市东城区天坛西里4 号 (72)发明人 孙静华　李小林　 (74)专利代理 机构 北京市领专知识产权代理有 限公司 1 1590 专利代理师 黄龙龙 (51)Int.Cl. C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C40B 40/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种构建原核生物RNA测序文库的方法 (57)摘要 本发明提供一种构建原核生物RNA测序文库 的方法。 该方法可为原核 生物mRNA加上一个延长 序列， 利用这个延长序列可以高效率地调取和反 转录原核生物RNA； 同时， 该方法可以为每个原核 生物原始mRNA分子标记分子标签， 以避免PCR偏 好性对检测准确性的影 响， 从而获得低偏好性高 准确性的原核 生物mRNA测序文库。 与传统的原核 生物RNA测序文库构建方法相比， 本方法构建的 文库偏好性低， 同时本方法操作简便， 成功率高， 同样适用于极低起始量样本(小于2ng总RNA)的 检测。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 114657646 A 2022.06.24 CN 114657646 A 1.一种构建原核生物RNA测序文库的方法， 该 方法包括下述 步骤： 获取RNA： 提取原核生物RNA序列； 加延长序列： 在RNA序列的3'端加如SEQ  ID No.1所示的核苷酸序列， 得到延长的RNA序 列； 反转录： 对延长的RNA序列采用如SEQ  ID No.2所示的核苷酸序列进行反转录得到cDNA 序列； 建库： 采用cDNA序列构建测序用文库。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 在所述反转录步骤之后进行去除rRNA的步骤。 3.根据权利要求1所述的方法， 其 中， 提取的原核生物 RNA的质量为0.1 –2000ng， 优选的 质量为0.2–1000ng， 更优选的质量 为0.5–500ng。 4.根据权利要求1所述的方法， 其中， SEQ  ID NO： 1所示的核苷酸序列由脱氧核糖核苷 酸和/或核糖核苷 酸组成， 优选的核糖核苷酸的比例为0 ‑80％， 更优选的核糖核苷 酸的比例 为0‑50％， 进一步优选的核糖核苷酸的比例为0 ‑25％， 进一步优选的核糖核苷酸的比例为 0‑10％， 最优选的核糖核苷酸的比例为0， 即此时SEQ  ID NO： 1所示的核苷酸序列均由脱氧 核糖核苷酸组成。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中， SEQ  ID NO： 2所示的核苷酸序列引物由脱氧核糖 核苷酸和/或核糖核苷酸组成， 优选的核糖核苷酸的比例为0 ‑80％， 更优选的核糖核苷 酸的 比例为0‑50％， 进一步优选的核糖核苷酸的比例为0 ‑25％， 进一步优选的核糖核苷酸的比 例为0‑10％， 最优选的核糖核苷酸的比例为0 。 6.根据权利要求1所述的方法， 其中， 在所述反转录步骤之后对cDNA序列进行PCR得到 扩增的cDNA序列。 7.一种原核生物RNA测序文库， 其通过权利要求1 ‑6任一项所述的方法获得， 其至少包 含RNA序列或其反向互补序列， 延长序列或其互补序列， 以及分子标签或其反向互补序列。 8.一种原核生物RNA测序文库的测序 方法， 其对通过权利要求1 ‑6任一项所述的方法构 建的文库进行测序。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657646 A 2一种构建原核生物RNA测序文库的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种构建原核生物RNA测序文库的方法， 属于基因测序技 术领域。 背景技术 [0002]随着基因测序技术水平的提高以及人类基因组计划、 癌症基因组计划、 Meta ‑Hit 计划等重大项目的相继开展， 基因组研究和RNA测序日渐成为生物和医学研究 的有力工具。 大量生物学和医学研究的新成果是由RNA测序发现或验证的。 然而， 目前多数RNA研究的对 象是真核生物， 这也与真核生物RNA测序建库方法的准确率和稳定性优于原核生物测序建 库方法有一定关系， 因此， 对原核生物的RNA研究需要更好的RNA测序建库方法支持。 [0003]真核生物和原核生物的信使RNA(mRNA)都占其总RNA的5 ‑10％， 而核糖体RNA (rRNA)却占RNA总量80％以上。 mRNA携带遗传信息并能指导蛋白质合成， 是RNA测序的主要 研究对象。 而rRNA并不携带遗传信息， 因此在构建RNA测序文库时需要去除rRNA以减少无用 测序。 传统的原核生物RNA测序需要通过随机引物反转录RNA， 获得cDNA并建库。 由于使用了 随机引物， 每条RNA上会结合多条引物进行反转录， 这会导致不可预测的扩增偏好， 影响检 测的准确性。 同时由于随机引物结合能力参差不齐， 不适用于极低起始量(0.02 ‑20ng)的样 本。 在2020年， Chatarin  Wangsanuwat等发明了EMBR ‑seq， 用封闭引物结合rRNA， 通过反转 录获得mRNA反转录的cDNA并构建测序文库。 该方法有两个缺点， 一是反转录所用引物的调 取效率和特异性不高， 在低起始量样本中会表现出调取基因数量较低。 二是rRNA封闭引物 操作复杂， 而RNA样 本又极易降解， 很容易在反转录步骤之前就 发生了严重的RNA降解现象， 因此该方法的建库成功率会低于传统方法。 发明内容 [0004]鉴于上述现有技术中存在的不足， 本发明的目的在于提供一种高效、 高成功率、 低 偏好性、 便于实验操作的构建原核生物RNA测序文库的方法。 [0005]本发明为解决上述问题进行了深入研究， 结果发现： 通过对原核生物的RNA加包含 分子标签的特殊延长序列， 这样处理的RNA能够直接使用部分序列与特殊的延长序列反向 互补的引物进行反转录， 同时还能够在反转录出的cDNA中包含延长序列中的分子标签， 通 过分子标签可以解决PCR偏好性的问题。 这样既高效地捕捉了RNA， 又降低了测序数据的偏 好性， 提高测序结果的准确率。 此外， 还在cDNA扩增之后进行去除rRNA的步骤， 这样在反转 录前RNA仅需加延长序列这一步处理， 通过尽量减少反转录前的操作降低了RNA降解的风 险。 通过采用本发明的RNA文库构建方法， 可以高成功 率、 高效、 简 便地获得低偏好性的原核 生物RNA测序文库。 [0006]即， 本发明包括， [0007]1.一种构建原核生物RNA测序文库的方法， 该 方法包括下述 步骤： [0008]获取RNA： 提取原核生物的RNA序列； [0009]加延长序列： 在RNA序列的3'端加如SEQ  ID No.1所示的核苷酸序列， 得到延长的说　明　书 1/7 页 3 CN 114657646 A 3