(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210383359.6 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 广东省华晟生物技 术有限公司 地址 511316 广东省广州市增城区新城大 道400号增城低碳总部园新城创业中 心14号楼1902室 申请人 佛山科学技术学院 (72)发明人 盛圆贤　黄淑坚　刘兆洁　梅堃　 许芬芬　柯骏鸿　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 蒋斌 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6837(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于禽腺病毒4型检测的引物、 探针、 基因芯 片、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及分子生物学技术领域， 具体涉及 用于禽腺病毒4型检测的引物、 探针、 基因芯片、 试剂盒及其应用。 本发明依据FAdV ‑4的相关基因 的多样性和规律性， 结合基因芯片的原理以及 TMB可视化显色系统的优势， 获得用于检测禽腺 病毒4型的引物和探针， 建立一种可视化显色的 基因芯片， 实现可视化检测禽腺病毒4型的目的。 该基因芯片的检测具有良好的特异性与灵敏度， 其检测灵敏度可达2.99 ×102copies/μL， 结果 准确， 稳定， 快速， 且结果只需肉眼即可判读， 具 有巨大推广价 值与广阔的商业前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表5页 附图3页 CN 114875023 A 2022.08.09 CN 114875023 A 1.引物， 所述引物包括FADV ‑4‑F和FADV‑4‑R； 所述FADV ‑4‑F的序列如SEQ  ID NO.2所 示； 所述FADV ‑4‑R的序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.探针， 所述探针为P1、 P2和P3中的至少一种； 所述P1的序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述 P2的序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述P3的序列如SEQ  ID NO.6所示。 3.引物和探针组合， 包 含权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。 4.基因芯片， 包 含权利要求2所述的探针。 5.根据权利要求 4所述的基因芯片， 其特 征在于： 优选地， 所述基因芯片还 包含： 芯片载体； 优选地， 所述基因芯片还 包含： 阳性指示探针； 优选地， 所述阳性指示探针的序列如SEQ  ID NO.7所示。 6.一种试剂 盒， 包含： 权利要求1所述的引物、 权利要求2所述的探针、 权利要求3所述的 引物和探针组合和权利要求 4～5中任一项所述的基因芯片中的至少一种。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于： 所述试剂盒包 含： 权利要求1所述的引物和权利要求 4所述的基因芯片。 8.根据权利要求7 所述的试剂盒， 其特 征在于： 所述试剂盒还 包含： 链酶亲和素 ‑HRP和TMB显色液。 9.权利要求1所述的引物、 权利要求2所述的探针、 权利要求3所述的引物和探针组合、 权利要求4～5中任一项所述的基因芯片或权利要求6～8 中任一项所述的试剂盒在非诊断 目的地禽腺病毒4型检测中的应用。 10.一种非诊断目的地检测禽腺病 毒4型的方法， 包括采用权利要求7～8中任一项所述 的试剂盒进行检测； 优选地， 所述方法包括如下步骤： 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 利用权利要求7～8中任一项所述的试剂盒中的引物 进行PCR扩增反应， 得到PCR扩增产物； 3)将PCR扩增产物置于权利要求7～8中任一项所述的试剂盒中的基因芯片上进行杂 交， 并通过向杂交反应中引入链酶亲和素 ‑HRP， 在显色过程中加入TMB显色液， 实现可视化 检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875023 A 2用于禽腺病毒4型检测的引物、 探针、 基因芯片、 试剂盒及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及用于禽腺病毒4型检测的引物、 探针、 基因芯片、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]禽腺病毒(Fowls  Adenovirus， FAdV)属于禽腺病毒科(Adenoviri dae)， 禽腺病毒 属 (Aviadenovirus)， 我国主要流行的FAdV有FAdV ‑4、 FAdV‑8及FAdV‑11， 其中FAdV ‑4就是 心包积液—肝炎综合征(HHS)的特异性病原。 由FAdV ‑4引起的HHS一年四季均可发生， 但夏 秋季更常发生， 一般呈隐性经过。 该病主要发生于3～5周龄的肉鸡， 蛋鸡、 麻鸡、 樱桃谷肉鸭 及鹅等家禽也可被FAdV ‑4感染。 另外， 鸽子、 不同种 类的隼及鹦鹉也可以成为  FAdV‑4的宿 主。 垂直传播是HHS的主要传播方式， 家禽接触被污染的机械、 工具和粪便也会造成该病的 大范围传播。 FAdV ‑4在多种家禽体内普遍存在， 既可以水平传播又可以垂直传播， 大大提高 了防控的难度。 虽然市面上有较多的灭活疫苗和弱毒疫苗， 但至今并没有一个商品化的疫 苗可以完全预防FAdV ‑4的感染。 因此， 不能仅仅依靠接种疫苗去预防HHS， 提高饲养管理水 平及提高种鸡引进时的检测水平也尤为重要。 [0003]目前针对FAdV ‑4的诊断方法包括血清 学及分子生物学方法。 间接酶联免疫吸附试 验 (Enzyme‑linked immunosorbent  assays， ELISA)、 病毒中和试验和琼脂扩散试验均被 广泛应用于禽腺病毒的血清学诊断， 常用血清学检测方法虽然操作简单， 成本低廉， 但检测 灵敏度较低， 尤其在低病毒载量情况下检测结果容易出现假阴性； 禽腺病毒分子生物学诊 断技术有  PCR、 qPCR、 LAMP技术及基因微阵列等技术， 其中PCR和qPCR常常被用于禽腺病毒 的实验室检测。 [0004]聚合酶链式反应(Polymerase  Chain Reaction,PCR)： 以DNA或cDNA为模板， 以一 对分别与模板5 ’末端和3’末端互补的寡核苷 酸片段为引物， 在DNA聚合 酶的作用下， 按照半 保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA 合成， 重复这一过程， 即可在短时间内使 目的DNA片段得到扩增从而得到大量的目的片段； 普通PCR虽具较高灵敏度与特异性、 且对 样品纯度要求低、 操作简单、 成本较低的优点； 但依赖于特异性引物设计， 以及结果观察需 要额外的凝胶电泳， 由于操作步骤与时间的增 加也带来了更多引入污染的概 率。 [0005]实时荧光定量P CR(Quantitativ e Real‑time PCR,qPCR)： 常用的qPCR方法分为染 料法 (SYBR Green I法)与探针 法(Taqman探针法)， 二者均为在PCR反应过程中加入荧光基 团， 利用荧光信号的增加来反映产 物的扩增， 在此过程中荧光定量P CR仪读取实时的荧光信 号， 监测出荧光信号达到预定阈值的循环数(Ct值)。 Ct值与病毒核酸浓度呈负相关， 病毒核 酸浓度越高， Ct值越小。 相较于普通PCR， 荧光定量PCR具有更优异的灵敏度和特异性； 而染 料法相较于Taqman探针法具有价格低廉的优势， 但探针法具有更高的敏感度， 因此在实际 的检测中按需选择不同的方案； 荧光定量PCR相较普通PCR具有更优异的特异性和 灵敏度， 且无需凝胶电泳， 以及更快的反应时间， 大大提升了实验结果的稳定性与可靠性。 但该方法说　明　书 1/7 页 3 CN 114875023 A 3