(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210384974.9 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 华北理工大 学 地址 063210 河北省唐山市曹妃甸区唐山 湾生态城渤海大道 21号 (72)发明人 郑林雪　周一君　郑小波　 (74)专利代理 机构 天津创智睿诚知识产权代理 有限公司 12 251 专利代理师 李蕊 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化 的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种SNAD工艺运行过程中微 生物群落结构变化的检测方法， 检测方法包括以 下步骤： 分别在SNAD工艺运行过程中的接种污泥 期、 亚硝化稳定期、 SNAD启动初期、 SNAD稳定初 期、 SNAD稳定期和SNAD稳定后期各取样1次， 得到 六个泥样； 将六个泥样静置10 ‑15min， 去除上清 液， 离心至少1次， 用于去除腐殖质， 将离心所得 固体提取总细菌DNA， 得到 六个DNA溶液； 进行PCR 扩增， 得到PCR扩增产物， 对PCR扩增产物进行变 性梯度凝胶电泳， 获得DGGE条带图谱， 得到SNAD 工艺运行过程中微生物群落结构变化。 本发明的 检测方法可以快速高效检测并了解实验周期中 各个节点上菌 群结构的动态变化。 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 CN 114686610 A 2022.07.01 CN 114686610 A 1.一种SNAD工艺运行过程中微生物群落结构变化的检测方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 1)分别在SNAD工艺运行过程 中的接种污泥期、 亚硝化稳定期、 SNAD启动初期、 SNAD稳定 初期、 SNAD稳定期和SNAD稳定后期各 取样1次， 得到六个泥样； 2)将步骤1)所得六个泥样 静置10‑15min， 去除上清液， 离心至少1次， 用于去除腐殖质， 将离心所 得固体提取总细菌DNA， 得到六个DNA溶 液； 3)进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 其中， 引物为F341 ‑GC(5'‑CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC CGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGA GGCAGCAG‑3')和EU500(5' ‑GTATTACCGCGGCTGCTGG ‑3')， PCR扩增采用降落式扩增程序， 具体 反应条件为： 94℃预变性5min； 94℃变性1min， 65℃退火 1min， 72℃延伸1min， 共进行2 0个循环， 每个循环降低0.5℃； 94℃变性1min， 55℃退火1min， 72℃延伸1mi n， 共进行3个 循环； 72℃延伸10mi n； 4)对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳， 获得D GGE条带图谱， 得到SNAD工艺运行过程 中微生物群落结构变化。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 在所述步骤1)中， 所述接种污泥期的 取样时间为SNAD 工艺运行的第1天， 所述亚硝化稳定期的取样时间为SNAD工艺运行的第2 4‑ 26天， 所述SNAD启动初期的取样时间为SNAD工艺运行的第39 ‑41天， 所述SNAD稳定初期的取 样时间为SNAD工艺运行的第49 ‑51天， 所述SNAD稳定期的取样时间为SNAD工艺运行的第59 ‑ 61天， 所述SNAD稳定后期的取样时间为SNAD工艺 运行的第73 ‑75天。 3.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 在所述步骤2)中， 所述离心的时间为 5‑6min， 所述离心的转速为15 000‑16000rpm。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特征在于， 在所述步骤2)中， 所述离心的次数为4 ～5次。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 在所述步骤2)中， 所述离心的温度为 4‑5℃。 6.根据权利 要求5所述的检测方法， 其特征在于， 在所述步骤3)中， PCR反应体系为： 将5 体积份数的10 ×PCR buffer、 4体积份数的dNTP、 1体积份数的F341 ‑GC、 1体积份数的EU500、 0.5体积份数的Taq  DNA聚合酶和2体积份数的DNA溶 液混合， 加重蒸水至 50体积份数。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114686610 A 2SNAD工艺运行过 程中微生物群落结构变化的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体来说涉及一种S NAD工艺运行过程中微生物   群落结构变化的检测方法。 背景技术 [0002]传统生物脱氮工艺处理城市生活污水存在占地面积大、 能耗高、 外加碳源不足等，   既增加了运行费用又增加了运行管理难度。 近几年随着微生物学及脱氮工艺运行的深入   研究， 出现了一些高效低耗的新型生物脱氮工艺， 其中厌氧氨氧化技术以其占地空间小、   运行费用低等优点受到了广泛的关注。 CANNON(completely  autotrophic  ammonium removal over nitrite)工艺可以通过AOB和anammox菌在一个反应器中的相互合作实现   总氮的去除， 主要用于高氨氮废水处理。 最近的研究表明， CANNON工艺也可以在低温  低氨 氮废水中实现。 高浓度有机物对厌 氧氨氧化的生长有一定的抑制作用， 但是当有机  物浓度 较低时， 亚硝化菌、 厌氧氨氧化菌、 反硝化菌可以在一个反应器中共存。 为此，  SNAD工艺以 SBR反应器为平台， 将亚硝化、 厌 氧氨氧化、 反硝化过程相结合， 最 终形 成同步亚硝化、 厌氧 氨氧化和反硝化耦合脱氮。 [0003]2009年杨凤林等人基于CANON工艺的理论基础， 提出了同步亚硝化 ‑厌氧氨氧化 ‑   反硝化(SNAD)的概念。 SNAD工艺是指在一个反应器中， 同时完成亚硝化、 厌氧氨氧  化和反 硝化的过程， 通过控制反应条件， 协调亚硝化菌、 厌 氧氨氧化菌和反硝化菌共同  行使功能， 从而达到同时脱氮的目的。 [0004]由于传统的培养技术在研究环境工程微生物的多样性和动力学等方面存在着严 重的 局限性， 使得现在 对于污水 处理工艺中微生物与处理效果关系性的研究仍处于 “黑盒 子”  阶段， 而近年发展起来的分子生物学技术很好地解决了这一问题。 P CR技术应用在污水   处理中具有很好的特异性和灵敏性， 所以处理操作上相对传统生物防治技术而言更加简   便， 当然该技术也有一定的局限， 在污水检测前要进行重复性酶促， 获得DNA扩增， 必  要时 还要利用到一些修正 或联合性衍生技术， 保证污水微生物检测的准确性。 同时， 成  功的PCR 实验离不开精准的实验设计和操作流程， P CR实验实施需要 经过优化以确保所  有反应参数 均设置精确， 从而获得准确的结果。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种快速、 灵敏、 高效的SNAD工艺   运行过程中微生物群落结构变化的检测方法， 该检测方法从SNAD工艺启动、 调试到基  本进 入稳定运行全过程检测微生物群落结构变化， 其直接从SNAD工艺运行全过程颗粒  污泥中 提取总DNA， 然后采用PCR ‑DGGE技术检测其中的微 生物菌群的组成。 [0006]本发明的目的是通过 下述技术方案予以实现的。 [0007]一种SNAD工艺 运行过程中微 生物群落结构变化的检测方法， 包括以下步骤： [0008]1)分别在SNAD工艺运行过程中的接种污泥期、 亚硝化稳定期、 SNAD启动初期、  说　明　书 1/5 页 3 CN 114686610 A 3