(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210394448.0 (22)申请日 2022.04.14 (71)申请人 中南大学 地址 410000 湖南省长 沙市岳麓区麓山 南 路932号 (72)发明人 郭亚东　尚艳杰　任立品　 (74)专利代理 机构 西安硕大知识产权代理事务 所(普通合伙) 61283 专利代理师 张德兴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒及应 用 (57)摘要 本发明公开了一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推 断试剂盒及应用， 首次筛选出一种可以用于推算 棕尾别麻蝇蛹期发育时间的差异表达基因， 分子 标记evm.model.Contig  1.824目的基因， 然后根 据其DNA序列设计 特异性扩增引物组合， 以actin 为内参基因， 以不同发育日龄的棕尾别麻蝇蛹为 样本， 提取RNA， 然后反转录cDNA为模板， 进行目 的基因的qRT ‑PCR扩增和相对定量分析， 获得该 目的基因在棕尾别麻蝇不同发育日龄蛹样本中 的相对表达量变化， 同时获得棕尾别麻蝇该目的 基因相对表达量和蛹期发育日龄的拟合回归方 程， 通过检测现场棕尾别麻蝇蛹期样本中 evm.model.Contig  1.824目的基因的相对表达 量， 计算棕尾别麻蝇蛹期 的发育日龄， 进而用于 PMI推断。 本发明操作简便， 实用性强， 便于推广 和使用。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 114752682 A 2022.07.15 CN 114752682 A 1.一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒， 其特征在于， 包括用于推算棕尾别麻蝇蛹期 发育时间的分子标记， 所述分子标记为evm.model.Contig  1.824目的基因， 所述 evm.model.Co ntig 1.824目的基因的DNA序列如NO.1所示； 所述分子标记evm.model.Contig  1.824目的基因设计的引物组合物， 所述引物组合物 为用于检测evm.model.Co ntig 1.824目的基因表达量的引物组合物； 所述用于检测evm.model.Contig  1.824目的基 因的引物组合物包括1.824 ‑F和1.824 ‑ R， 所述1.824 ‑F的DNA序列如NO.3所示， 所述1.824 ‑R的DNA序列如NO.4所示。 2.一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒， 其特征在于， 包括用于推算棕尾别麻蝇蛹期 发育时间的分子标记， 还包括用于校正目的基因表达量的evm.model.Contig ‑actin内参基 因， 所述evm.model.Co ntig‑actin内参基因的DNA序列如实施例1中NO.2所示； 所述用于检测evm.model.Contig ‑actin内参基因的引物组合物包括actin ‑F和和 actin‑R， 所述acti n‑F的DNA序列如NO.5所示， 所述acti n‑R的DNA序列如NO.6所示。 3.基于权利要求1或2所述的一种用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的试剂盒应用方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 以不同发育日龄的棕尾别麻蝇蛹为样本， 提取RNA， 然后反转录 cDNA为模板； S2、 通过引物组合物， 应用App lied biosystems  7500实时荧光定量PCR仪检测仪器， 进 行evm.model.Contig  1.824目的基因与evm.model.Contig ‑actin内参基因的qRT ‑PCR扩 增； S3、 对所述扩增的目的基因进行相对定量分析， 获得该目的基因在棕尾别麻蝇不同发 育日龄蛹样本中的相对表达量变化； S4、 绘制该目的基因相对表达量和棕尾别麻蝇蛹期发育日龄的拟合回归方程： Y＝2.80744+2.49763*x， 所述Y为蛹期日龄， 所述X为evm.model.Contig  1.824目的基 因的相对表达量， 即evm.model.Contig  1.824目的基因与evm.model.Contig ‑actin内参基 因的CT差值( △CT)； S5、 在实际案件中， 通过检测现场棕尾别麻蝇蛹期样本中evm.model.Contig  1.824目 的基因的相对表达量， 代入上述拟合线性回归方程， 然后可以计算棕尾别麻蝇蛹期的发育 日龄， 进而用于PMI推断。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752682 A 2一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明属于法医昆虫学技术领域， 特别涉及一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒 及应用。 背景技术 [0002]死亡时间(Postmortem  Interval,PMI)推断是指尸体被发现时距死亡时刻间隔的 推测和判断， 在案件线索提供、 侦查范围划定、 作案时间分析、 案件定性等方面均有重要意 义。 PMI推断是刑事案件侦破的关键环节， 也是法医学实践难点和研究热点。 近年来， 法医昆 虫学在PMI推断， 特别 是腐败尸体PMI推断等方面体现出较好的应用前景， 其中嗜尸性蝇类 在PMI推断方面具有自身独特的优势， 其应用价 值较高， 受到法医昆虫 学者的广泛关注。 [0003]以前的专利或者研究通常关注幼虫期的年龄推断， 然而通常来说， 嗜尸性蝇类蛹 期发育时间较长， 占总发育历期的一半以上， 是案件现场最常见的蝇类虫态， 我们需要经常 利用嗜尸性蝇类的蛹期日龄来进 行尸体PMI推断， 因此， 蛹期日龄的推断在实际应用中比幼 虫期更显得重要， 且相对于幼虫期可以用体长、 体重等指标来推断日龄外， 嗜尸性蝇类蛹期 发育日龄推断目前的一些方法缺乏客观判断指标， 严重影响了蝇类证据的准确性和科学性 进而阻碍其在法庭科学中被采纳应用， 成为限制法医昆虫学发展的关键性问题， 因此， 寻找 一种更加客观的嗜尸性蝇类蛹期日龄推断方法对于昆虫证据的应用非常重要。 [0004]嗜尸性蝇类是全变态发育昆虫， 蛹期发育是一个细胞增殖、 组织重塑、 细胞迁移和 程序性死亡的过程， 许多基因参与到这些过程和 变化中， 差异表达基因(DEGs)在嗜尸性蝇 类蛹期日龄推 断中具有巨大 的潜力， 而且差异表达基因的结果客观性强， 弱化了人为主观 臆断因素， 在法庭上更容易被接受， 同时也能进行误差计算， 更符合杜伯特法则的需求。 转 录组学是继基因组学后另一大组学研究热点， 近年来转录组测序技术发展迅速， 测序和数 据分析技术愈发成熟， 开展转录组测序、 基因筛选和 生物信息分析研究可以为法医昆虫学 蛹期日龄推断研究提供大量可供选择的高灵敏度年龄指示基因， 建立嗜尸性昆虫蛹期日龄 推断的新方法。 [0005]棕尾別麻蝇(Sarcophaga  peregrina)是尸体上常见的嗜尸性蝇类， 在死亡时间 (PMI)推断等方面具有独特的优势， 是一种重要的嗜尸性蝇类。 因此， 利用转录组学筛选差 异表达基因作为分子标记来进 行棕尾别麻蝇蛹期日龄的精确推断， 对于棕尾别麻蝇在法医 昆虫学PMI推断中的应用具有重要意 义。 发明内容 [0006]为了实现上述目的， 本发明提供一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒及应用。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用的技 术方案是： [0008]一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒， 包括用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的 分子标记， 所述分子标记为evm.model.Contig  1.824目的基因， 所述evm.model.Contig   1.824目的基因的DNA序列如NO.1所示；说　明　书 1/7 页 3 CN 114752682 A 3