(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210391049.9 (22)申请日 2022.04.14 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430000 湖北省武汉市解 放大道127 7 号 (72)发明人 梅恒　李成功　胡豫　邓君　周芬　 (74)专利代理 机构 武汉信合红谷知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 42264 专利代理师 严情 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)G01N 33/574(2006.01) G01N 33/532(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方 法 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 公开了通用的 CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方法。 具体的， CAR拷贝数检测剂为探针和引物对及其 混合物或 试剂盒中任 一； 检测探针， 其具有如SED  ID NO： 1 所示序列； 检测引物对， 其分别具有如SED  ID  NO： 3和SED  ID NO： 4所示序列。 针对HIV前病毒保 守序列的检测剂在制备CAR修饰免疫细胞治疗中 CAR拷贝数检测产品中的应用， 其中， CAR基于HIV 改造的慢病毒载体转染至效应细胞。 应用方法包 括用前叙探针、 引物对配成PCR反应体系及后续 定量PCR的检测步骤。 本发明的探针和引物对针 对HIV保守的前病毒序列5 ’LTR， 可以精确检测所 有以HIV改造慢病毒载体转导CAR的拷贝数， 具有 通用性和普适性； 检测的灵敏度高； 不需要标准 品。 权利要求书1页 说明书9页 附图5页 CN 114717317 A 2022.07.08 CN 114717317 A 1.CAR拷贝数检测剂， 其特 征在于， 其至少包 含下述中之一 i)检测探针， 其具有如SED  ID NO： 1所示序列： 5’ ‑AACCCACTGCTTAAGC‑3’； ii)检测引物对， 序列为： FR： 5’ ‑CCTGGGAGCTCTCTG GCTAA‑3’； RP： 5’ ‑CACTGACTA AAAGGGTCTGAGGG‑3’。 2.根据权利要求1所述的CAR拷贝数检测剂， 其特征在于， CAR修饰的细胞免疫治疗中 CAR以HIV改造的慢病毒载体转 导。 3.根据权利要求2所述的CAR拷贝数检测剂， 其特 征在于， CAR产品为瑞基奥仑赛。 4.根据权利要求1所述的CAR拷贝数检测剂， 其特 征在于， 所述检测探针中， 荧光报告基团至少选自FAM、 Hex、 VIC、 ROX、 Cy5中任一， 荧光淬灭基团至少选自BHQ1、 TAMRA、 JOE、 BHQ2、 BHQ3、 MGB中任一。 5.针对HIV前病毒保守序列的检测 剂在制备CA R拷贝数检测产品中的应用； 其中， CA R基 于HIV改造的慢病毒载体转染至效应细胞。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述HIV前病毒保守序列为HIV  5’LTR序 列； CAR拷贝数为CAR修饰免疫 治疗中CAR。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述HIV前病毒保守序列检测剂为权利要 求1‑4任一所述检测剂。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特 征在于， CAR ‑T治疗中细胞治疗物为瑞基奥仑赛。 9.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述应用为针对HIV前病毒保守序列的检 测剂在制备CAR修饰免疫治疗中CAR转导效率、 CAR浓度、 CAR体内扩增和持续检测产品中的 应用； 所述效应细胞包括T细胞、 NK细胞等。 10.CAR修饰免疫治疗CAR拷贝数检测方法， 其特征在于， 包括下述步骤配制PCR反应体 系， 其中包 含 待检样品， 探针， 其序列为5 ’ ‑FAM‑AACCCACTGCTTAAGC‑MGB‑3’， 和/或引物， 其序列为 FR： 5’ ‑CCTGGGAGCTCTCTG GCTAA‑3’， RP： 5’ ‑CACTGACTA AAAGGGTCTGAGGG‑3’； 后续定量PCR的检定步骤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717317 A 2通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 尤其涉及通用的CAR拷贝数的检测剂及其应用和应用 方法。 背景技术 [0002]嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗在血液肿瘤中展示了极高的有效性， 被 《science》 评为2013年度 “十大科学突破之首 ”， 入选中国2020年度十大生命科学进展。 目前已有 Kymriah,Yescarta,Tecartus,Abecma, (西达基奥仑赛)5款细胞治 疗产品获 得FDA批准用于治疗急性B细胞白血病、 淋巴瘤和骨髓瘤， 我国食品药品监督管理局也批准 了阿基伦赛、 瑞基奥仑赛2款细胞治疗产品上市。 CAR ‑T细胞在体内的定植、 扩增、 存续与其 临床安全性和疗效密切相关， 已有研究表明CAR ‑T扩增高峰和回输后28天内扩增的曲线下 面积与临床反应和安全性相关， 体内存续与缓解时间相关， 因此密切监测体内CAR ‑T细胞对 于临床管理十分重要。 然而， 由于CAR ‑T结构的复杂性和多样性， 目前尚无统一的准确定量 方法。 [0003]随着CAR‑T技术的发展和成熟， 出现了CAR修饰的其他效应细胞， 包括CAR ‑NK、 CAR‑ 巨噬、 CAR ‑抑制性T细胞等。 以CAR ‑NK疗法为例， NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、 短暂 的生理周期、 广泛的肿瘤杀伤能力等优势， 被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能 力的效应细胞。 NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞， 其对 肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。 当识别肿瘤 细胞之后， NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、 表达膜TNF家族分子诱 导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤 细胞。 [0004]荧光定量PCR是一种依据倍比稀释的标准品扩增的Ct值来推算待测样本中目标分 子含量的一种定量PCR技术， 是 目前监测CAR拷贝数最常用的手段。 然而， 由于CAR结构的多 样性和复发性， 目前已知的引物和探针是针对FMC63和4 ‑1BB‑CD3z的接头区(1.Cancers (Basel).2020Sep  30； 12(10):2820； 2.Mol  Ther Methods Clin Dev.2020Dec  10； 20:535 ‑ 541.)， 部分CAR ‑T产品如瑞基奥仑赛尚无有效的引物和探针； 其次， 荧光定量PCR需要已知 浓度的标准品， 限制了其在各大医院的常规检测； 另外， 荧光定量PCR需要至少3次重复， 检 测阈值受环境和操作影响较大， 难以准确定量和定性。 [0005]数字化PC R具有高度的敏感性、 特异性和可重复性， 是一种可以用于准确定量稀有 事件的定量P CR技术。 大部 分CAR是借助 慢病毒载体转染到T细胞上的， 目前常用的慢病毒载 体是基于HIV病毒改造的， 保守的前病毒序列会随着CAR一起转染到宿主细胞， 针对前病毒 序列设计探针和引物可以检测所有基于 HIV的慢病毒转染CAR的拷贝数。 发明内容 [0006]针对上述问题， 本发明给出了通用的CAR拷贝数检测剂及其应用和应用方法， 主要 解决了现有的检测探针引物普适 性差， 检测精度低等问题。说　明　书 1/9 页 3 CN 114717317 A 3