(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210391182.4 (22)申请日 2022.04.14 (71)申请人 南京博雷兹生物科技有限公司 地址 211103 江苏省南京市江宁区淳化 街 道乾德路9号金都科技园02栋8层0810 室 (72)发明人 王占奎　陈明　杨云华　王敏　 (74)专利代理 机构 安徽顺超知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 34120 专利代理师 贺湘君 (51)Int.Cl. G01N 33/53(2006.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均 相免疫分析方法 (57)摘要 本发明涉及均相免疫分析技术领域， 公开了 基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相 免 疫分析方法， 包括以下步骤： 合成抗体/抗原a ‑ DNA1偶联物， 浓度为： 1 ‑20nM； 合成抗体/抗原b ‑ DNA2偶联物， 浓度为： 1 ‑20nM； 合成背景消除探针 DNA3， 浓度为： 10 ‑100pM； 合成一级引导寡核苷酸 引物DNA4， 浓度为： 10 ‑100pM； 合成信号底物探针 DNA5/DNA6双链， 浓度为： 50 ‑100nM； 上述组分混 合均匀组成均相免疫分析试剂部分A， 常温等温 扩增试剂成分组成均相免疫分析试剂部分B， 使 用过程中依次将两部分与待检测样品充分混匀。 本发明可通过样品与检测溶液的直接混合完成 目标的检测， 无需固体生物识别载体和复杂的清 洗、 分离步骤， 操作 简单， 成本低廉， 较为实用， 适 合广泛推广和使用。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 114814194 A 2022.07.29 CN 114814194 A 1.基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 包括以下 步骤： 合成抗体/抗原a ‑DNA1偶联物， 浓度为： 1 ‑20nM； 合成抗体/抗原b ‑DNA2偶联物， 浓度为： 1 ‑20nM； 合成背景消除探针DNA3， 浓度为： 10 ‑100pM； 合成一级引导寡核苷酸引物DNA4， 浓度为： 10 ‑100pM； 合成信号底 物探针DNA5 /DNA6双链， 浓度为： 5 0‑100nM； 上述组分 混合均匀组成均相免疫分析 试剂部分A； 同时配制常温等温扩增试剂成分组成均相免疫分析 试剂部分B； 将含有靶标蛋白的样品溶液与均相免疫分析试剂部分A溶液充分混合， 在37℃条件下 温育10分钟， 此过程中， 抗体/抗原a ‑DNA1偶联物和抗体/抗原b ‑DNA2偶联物实现免疫识别 反应， 靶标蛋白将被抗体/抗原a ‑DNA1偶联物和抗体/抗原b ‑DNA2偶联物识别并形成免疫复 合物， DNA1和DNA2距离靠近产生邻位杂交形成杂交链， 而背景消除探针DNA3可以防止背景 假性杂交； 然后加入试剂部分B并充分混匀， 在37℃条件下温育10分钟， 此过程中， 对杂交链进行 末端补齐， 并在一级引导寡核苷 酸引物DNA 4作用下进 行链置换扩增出大量的二级信号放大 寡核苷酸引物， 同时二级信号放大寡核苷酸引物置换出底物探针单链， 实现检测信号的释 放； 温育完成后， 放入检测仪器， 在一定波长的激光激发下发出荧光信号， 进行光信号采 集， 并通过 标准曲线换算得到浓度值。 2.根据权利要求1所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述抗体/抗原a ‑DNA1偶联物和抗体/抗原b ‑DNA2偶联物中， 抗体/抗原a与 DNA1和抗体/抗原b与DNA2均通过一段寡聚胸腺嘧啶(poly ‑T)进行桥接， 所述寡聚胸腺嘧啶 (poly‑T)序列长度为15 ‑25个碱基。 3.根据权利要求2所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述DNA1的3 ’端通过poly ‑T桥接后与抗体/抗原a偶联， 其碱基序列由3 ’端到 5’端依次分为DNA1a、 DNA1b、 DNA1c三部分， 其中DNA1a为邻位杂交核心部分， 其序列长度为 6‑8个碱基， 所述DNA2的5 ’端通过poly ‑T桥接后与抗体/抗原b偶联， 其碱基序列由5 ’端到3’ 端为DNA2a， 且与DNA1a在序列结构上能够碱基互补配对。 4.根据权利要求3所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述背 景消除探针DNA3中间核心序列能够与DNA1 a和DNA1b衔接部分序列互补 配对， 背景消除探针DNA3中间核心序列起到防止假性自杂交作用， 其序列长度为8 ‑12个碱 基， 其5’端和3’端各含有3 ‑5个游离碱基无法与DNA1序列互补配对。 5.根据权利要求4所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述一级引导寡核苷 酸引物DNA 4序列能够与DNA1b序列互补配对， 进 行链置换 扩增出DNA1b ‑DNA1c的互补核酸单链。 6.根据权利要求5所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述信号底物探针DNA5/DNA6双链中， 其双链一端序列与DNA1c序列相同或互 补， 双链另一端的单链5 ’端和3’端分别标记有荧 光基团和荧 光淬灭基团。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114814194 A 27.根据权利要求1所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述常温等温扩增试剂成分包括RecA蛋白、 Ecoli  RecFOR蛋 白复合体、 λ噬菌 体Redβ 蛋白、 单链结合蛋白(SSB)、 适用于25 ‑42℃的DNA聚合酶、 乙酸镁、 dNTP， 其最终浓度 分别为： 75 ‑150 μg/mL、 40 ‑80 μg/mL、 75 ‑150 μg/mL、 2 ‑10 μM、 50‑150 μg/mL、 2 ‑30mM、 1‑10mM。 8.根据权利要求7所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述常温等温扩增试剂 中还包括镁离子， 用于维持结构稳定和 促进常温等温 扩增反应， 其终浓度为2 ‑30mM； 单链结合蛋白， 用于降低反应背 景信号和促进常温等 温扩增 反应， 其终浓度为2 ‑10 μM。 9.根据权利要求1或8所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统的均相免疫分析方 法， 其特征在于： 所述常温等 温扩增试剂的组成能够在25 ‑42℃条件下进 行的具有链置换扩 增的反应。 10.根据权利要求6所述的基于核酸常温等温扩增放大信号系统 的均相免疫分析方法， 其特征在于： 所述DNA1序列(5 ’ ‑3’)为： 5′ ‑CGCTTGAACGCTGTGCTAGATGTGCTGAGGATAGGATGGT ‑ poly‑T‑3’； 所述DNA2序列(5 ’ ‑3’)为： 5′ ‑poly‑T‑CTATCCT‑3′； 所述DNA3序列(5 ’ ‑3’)为： 5′ ‑TTTATCCTCAGCAT TTT‑3′； 所述DNA4序列(5 ’ ‑3’)为： 5′ ‑CAGCACATCTA ‑3′。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114814194 A 3