(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210393576.3 (22)申请日 2022.04.15 (71)申请人 中国医学 科学院病原生物学研究所 地址 100176 北京市大兴区经济技 术开发 区荣京东 街6号 (72)发明人 彭俊平　李雅梅　 (74)专利代理 机构 北京华科联合专利事务所 (普通合伙) 11130 专利代理师 王为 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种生殖支原体parC基因突变类型的检测 方法与试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种生殖支原体parC基因突 变类型的检测方法与试剂盒， 所述检测方法用于 检测生殖支原体parC基因的8个突变类 型， 其中8 个突变类型的检测靶标为(1)ParC  S83I， (2) ParC S83C， (3)ParC  S83N， (4)ParC  S83R， (5) ParC D87G， (6)ParC  D87N， (7)ParC  D87H， (8) ParC D87Y， 本发明进 一步提供分别针对8个突变 类型检测的反应引物序列 SEQ ID NO.1至SEQ  ID  NO.9， 本发明利用高分辨率熔解曲线分析技术 (High Resolution  Melting， HRM)结合未标记探 针检测所述8个突变 类型。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 114703306 A 2022.07.05 CN 114703306 A 1.用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型的专用引物， 所述parC基因的8个突变 类型的检测靶标为： (1)ParC  S83I， (2)ParC  S83C， (3)ParC  S83N， (4)ParC  S83R， (5)ParC   D87G， (6)Par C D87N， (7)Par C D87H， (8)Par C D87Y； 所述引物序列为SEQ  ID NO.1至SEQ  ID  NO.9。 2.根据权利要求1所述的引物， 其特征在于， 所述引物共有4套引物 组， 第一套引物 组由 三条引物组成， 一条为正向引物， 一条为反向引物， 最后一条为3 ’端磷酸化的引物； 其余三 套引物组由两条引物组成， 一条为正向引物， 一条为反向引物， 分别针对parC基因的8个突 变类型， 其对应关系见表1。 3.一种用于检测生殖支原体parC基因 的8个突变类型的检测试剂盒， 其特征在于， 包括 权利要求1所述的引物。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括检测过程中必要的试剂或物品。 5.根据权利要求4所述的检测试剂盒， 其特征在于， 试剂盒中的试剂或物品， 包括采样 管、 粗提试剂Lysis  buffer、 反应组分EvaGreen  Master Mix(扩增酶、 扩增buffer、 dNTP和 EvaGreen荧光染料)、 阳性对照和阴性对照， 所述阳性对照为为各检测靶点的野生型阳性样 本， 所述阴性对照为d dH2O。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所包括的检测试剂 或物品的量为1人份， 或多人份， 所述多人份可以是2 ‑1000人份。 7.一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测方法， 其特征在于， 包括使用3 ‑6所 述的试剂盒的步骤。 8.根据权利要求7 所述的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)使用试剂盒方法或裂解法完成样本基因 组DNA的提取； 2)以待测样本的基因组DNA为模板， 在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体 系， 进行特异性扩增； 3)在PCR过程 中， 由于目标序列的序列特异性， 会造成不同PCR产物的碱基含量差异， 根 据DNA本身的性质， 在饱和染料的作用下， 对P CR扩增子进 行加热， 通过实时监测升温过程中 荧光强度的变化， 将检测结果进行数据整合及图像绘制， 生成PCR产物熔解曲线， 根据熔解 曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。 9.根据权利要求7 所述的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)使用试剂盒提供的样本采集管收集病人生殖道分泌物或者尿液样本； 2)对于尿液样本， 8,000rpm离心10min后， 弃上清， 向样本采集管中加入适量粗提试剂 Lysis buffer； 对于分泌物的拭子样本， 向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysi s buffer， 搅拌， 将拭子浸泡在Lysis  buffer中5mi n； 3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中， 95℃加热10min， 室温静置， 完成样本基因组 DNA的提取； 4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板， 在2个Assay的引物组中实现生殖支原体 parC基因的8个突变类型的检测， 其中2 0 μl的反应体系包括： 10 μl的EvaGreen  Master Mix， Assay中各引物的最佳扩增浓度见表1， 样本基因组DNA  2 μl， ddH2O补足至20 μl， 每次检测反 应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管； 5)在QuantStudio  6Flex Real‑Time PCR System进行扩增反应和HRM分析， 扩增反应权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114703306 A 2的条件为： 95℃孵育10分， 接着95℃退火15秒， 60℃延伸1分钟， 共进行30个循环扩增反应结 束后， 40℃孵 育1分钟， 随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温， 连续收集 荧光信号； 6)反应结束后使用QuantStudio  6and 7Flex Real‑Time PCR software  v1.0进行分 析， 软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值， 通过与不同突变型别的阳性对照进行 对比， 判断结果， 若待测样本的parC突变位点突变型别与对照样本相同则熔解曲线形状无 变化， 若待测样本与对照样本不同会形成突变， 熔解曲线形状也会相应发生改变。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114703306 A 3