(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210400751.7 (22)申请日 2022.04.17 (71)申请人 吉布森生物科技 （陕西） 有限公司 地址 710065 陕西省西安市高新区高新 一 路25号创新大厦N315 (72)发明人 董永花　张伟杰　 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) A61K 8/60(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) (54)发明名称 一种重组 anti-miR-129 -5p及其制备方法和 在抗皮肤衰老中的应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学及医学技术领域， 公 开了一种重组 anti‑miR‑129‑5p及其制备方法和 在抗皮肤衰老中的应用， 所述重组基因的序列为 SEQ ID NO： 1， 或为与SEQ  ID NO： 1所示序列相似 度达90％以上的序列。 本发明还公开了重组 anti‑miR‑129‑5p的生产方法及应用。 本发明利 用tRNA支架表达的具有生物学活性的anti ‑miR‑ 129‑5p相比于化学合成的anti ‑miR‑129‑5p， 生 产快、 产量高， 价格低廉， 功能性好、 安全性高。 本 发明制备的重组 anti‑miR‑129‑5p可以通过提高 皮肤成纤维细胞的活性， 抑制衰老标志基因表 达， 促进胶原蛋白的表达， 发挥抗皮肤衰老的作 用。 权利要求书1页 说明书13页 序列表2页 附图6页 CN 114854744 A 2022.08.05 CN 114854744 A 1.一种重组基因， 其特 征在于， 所述重组基因的序列为SEQ  ID NO： 1。 2.如权利要求1所述的重组基因， 其特征在于， 所述重组基因的序列为与SEQ  ID NO： 1 所示序列相似度达90％以上的序列。 3.一种应用如权利要求1所述的重组基因 的制备方法， 其特征在于， 所述重组基因 的制 备方法包括： 根据genebank数据库中设计anti ‑miR‑129‑5p引物并进行载体构建； 设计anti ‑miR‑ 129‑5p， 将设计的小干扰RNA  anti‑miR‑129‑5p嵌合于tRNA 支架， 在大肠杆菌中重组表达 。 4.如权利要求3所述的重组基因的制 备方法， 其特征在于， 所述小干扰RNA  anti‑miR‑ 129‑5p的序列为SEQ  ID NO： 2。 5.如权利要求4所述的重组基因的制备方法， 其特征在于， 所述嵌合序列为与SEQ  ID  NO： 2序列相似度达90％以上的序列。 6.如权利要求2所述的重组进一步的制备方法， 其特征在于， 所述tRNA支架的序列为与 人丝氨酸tRNA序列相似度达90％以上的序列， 所述人丝氨酸tRNA序列为SEQ  ID NO： 3。 7.如权利要求3所述的重组基因的制 备方法， 其特征在于， 所述小干扰RNA  anti‑miR‑ 129‑5p的前体序列为成熟序列部分被anti ‑miR‑129‑5p序列取代的hsa ‑miR‑34a前体序列， 所述小干扰RNA  anti‑miR‑129‑5p的前体序列为SEQ  ID NO： 4。 8.如权利 要求3所述的重组基因的制备方法， 其特征在于， 所述重组anti ‑miR‑129的制 备方法具体包括以下步骤： 步骤一， 设计合成 嵌合anti ‑miR‑129‑5p序列的hsa ‑miR‑34a前体引物； 步骤二， 利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点， 将小干扰RNA   anti‑miR‑129‑5p的前体序列插 入pBSMrnaSeph质粒中， 构建表达载体； 步骤三， 将嵌合目标序列的表达载体转 化感受态大肠杆菌； 步骤四， 大肠杆菌培养扩增后， 提取菌内总RNA， 以FPLC分离纯化目标重组anti ‑miR‑ 129‑5p。 9.一种抗衰化妆品， 其特 征在于， 所述 抗衰化妆品利用利要求1所述的重组基因制备。 10.如权利要求9所述的抗衰化妆 品， 其特征在于， 所述抗衰化妆 品的剂型包括膏霜类、 乳液类、 液洗类和水剂类。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854744 A 2一种重组a nti‑miR‑129‑5p及其制备方 法和在抗皮肤衰老中 的应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及医学技术领域， 尤其涉及一种重组anti ‑miR‑129‑5p及 其制备方法和在抗皮肤衰老中的应用。 背景技术 [0002]目前， 人体皮肤位于人体的最外层， 直接受外界环境等多种因素的影响。 衰老的皮 肤中表皮更新减慢、 屏障功能减弱、 角质形成细胞活力下降、 表皮受伤后修复能力减弱， 其 中屏障功能减弱后导致皮肤干燥、 脱屑、 皱纹等。 真皮衰 老表现为真皮层中成纤维细胞数量 逐渐减少， 其厚度变 薄、 合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力下降、 分解增加， I、 III型胶原比值 呈现倒置， 胶原逐渐变粗并出现异常交链， 许多代谢相关的酶类活性下降， 胞外间质中透明 质酸和硫酸皮肤素含量明显下降， 糖胺多糖总含量下降。 成纤维细胞作为真皮中最主要细 胞成分， 其在增殖能力及功能行使上的逐渐衰老是导 致皮肤衰老变化的重要原因之一。 [0003]MicroRNA(miRNA)是单链的非编码小分子RNA， 长度约20～24个核苷酸， 通过碱基 配对结合在mRNA的3 ’ ‑UTR或直接降解mRNA从而调控基因的表达。 基因与皮肤的衰老密切相 关， 随着年龄的增加， 细胞对DNA的修复能力下降， 引起细胞凋亡， 以及相关细胞 活性的基因 受到抑制。 所以mi RNA参与了很多与衰 老相关的重要 过程， 被广泛认 为是衰老的关键调控因 子。 研究发现在真皮组织中miR ‑129‑5p的表达上调可能降低成纤维细胞活性、 抑制胶原合 成， 从而参与真 皮组织的衰老过程。 [0004]目前用于研究的RNA 试剂， 主要采用化学合成， 但化学合成的RNA， 不仅价格昂贵产 率低， 而且为提高稳定性可能带有较多的人工基因修饰， 造成RNA折叠、 生物活性及安全性 受到影响。 [0005]通过上述分析， 现有技术存在的问题及缺陷为： 目前用于研究的RNA试剂 价格昂贵 且产率低， 而且为提高稳定性可能带有较多的人工基因修饰， 造成RNA折叠、 生物活性及安 全性受到影响。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种重组anti ‑miR‑129制备方法及其应 用， 尤其设计一种重组anti ‑miR‑129‑5p及其制备 方法和在抗皮肤衰老中的应用。 [0007]本发明是这样实现的， 一种重组基因， 所述重组基因的序列为SEQ  ID NO： 1， 或为 与SEQ ID NO： 1所示序列相似度达90％以上的序列。 [0008]本发明的另一目的在于提供一种应用所述的重组基因的重组anti ‑miR‑129的制 备方法， 所述重组基因的制备 方法包括： [0009]根据genebank数据库中设计anti ‑miR‑129‑5p引物并进行载体构建； 设计anti ‑ miR‑129‑5p， 将设计的小干扰RNA  anti‑miR‑129‑5p嵌合于tRNA支架， 在大肠杆菌中重组表 达。说　明　书 1/13 页 3 CN 114854744 A 3