(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210401694.4 (22)申请日 2022.04.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114752656 A (43)申请公布日 2022.07.15 (73)专利权人 暨南大学 地址 510000 广东省广州市天河区黄埔大 道西601号 (72)发明人 叶蕾　吕新瑞　张璜　曹炜伟　 阙慕仪　张依琳　石磊　 (74)专利代理 机构 广州市深研专利事务所(普 通合伙) 44229 专利代理师 姜若天 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 112877410 A,2021.0 6.01 CN 111893200 A,2020.1 1.06 CN 110564881 A,2019.12.13 CN 106191298 A,2016.12.07 CN 112195257 A,2021.01.08CN 110541022 A,2019.12.0 6 CN 112458190 A,2021.0 3.09 CN 112831580 A,2021.0 5.25 卢盼等.基 于CRISPR-Cas12a 蛋白的副溶 血 弧菌及tdh 基因检测分析. 《疾病监测》 .202 2,第 37卷(第3期), 张梦垚.基 于CRISPR技术的副溶 血性弧菌核 酸现场检测系统的研究. 《中国优秀硕士学位 论 文全文数据库 工程科技 辑》 .2022,(第I期), Mengyao Zhang等.Selective endpo int visualized detecti on of Vibri o parahaemo lyticus w ith CRIS PR/Cas12a assisted PCR usi ng thermal cycler for o n- site application. 《Talanta.》 .2020, Xingxing Xiao等.Rapid and Sensitive Detection of Vibri o vulnificus Usi ng CRISPR/Cas12a Combi ned With a Recombinase-Aided Ampl ification Assay. 《Front Microbi ol.》 .2021, 葛以跃等.CRIS PR-Cas13a结合重组酶介导 的扩增快速 检测副溶 血性弧菌方法的建立. 《现 代预防医学》 .2019,第46卷(第20期), (续) 审查员 娄菲 (54)发明名称 一种基于化学增强的CE-RAA -CRISPR快速检 测副溶血弧菌的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于化学增强的CE ‑RAA‑ CRISPR快速检测副溶血弧菌的方法。 本发明将 RAA扩增技术与CRISPR系 统相结合， 优化相关检 测条件， 筛选最优检测方法， 实现痕量食源副溶 血弧菌残留的检测。 并通过化学试剂的添加进一 步增强检测灵敏度。 本研究与传统的培养检测方 法相比， 克服了培养技术周期长， 过程繁冗， 安全 时效性差的难题， 与以往的分子检测技术相比，提高了灵敏度和准确性， 缩短致病菌检测的时 间， 以及提升了对多种细菌高通量的检测能力和 隐性细菌的鉴定能力。 [转续页] 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 114752656 B 2022.12.23 CN 114752656 B (56)对比文件 苏璇等.CRIS PR-Cas13a辅助RA A快速检测金 黄色葡萄球 菌的研究. 《中国病原生物学杂志》.2020,(第0 3期), 王群等.基于CRISPR/Cas蛋白的副溶 血弧菌 检测方法的研究. 《疾病监测》 .2020,(第0 6期),2/2 页 2[接上页] CN 114752656 B1.一种非疾病诊断目的 的副溶血弧菌的检测方法， 其特 征在于包括如下步骤： （1） RAA引物设计： 根据副溶 血弧菌特异性基因 tlh的保守序列， 设计3条RA A上引物： F1 AGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACAT TACG； F2 TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACAT TA； F3 TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACAT TACG； 以及3条RA A下引物： R1 GTCACCGAGTGCA ACCACTTTGTTGATTTGA； R2 TTGCCTGTATCAGACA AGCTGTCAC CGAGTG； R3 TGTTGCCTGTATCAGACA AGCTGTCAC CGAGTG； 根据引物扩增区域， 设计相对应s sDNA‑FQ探针； s sDNA‑FQ探针为： 6 ‑FMA‑TTATT‑BHQ1； （2） 采用CRIS PR体系： 根据扩增区域设计crRNA序列； 采用CRIS PR反应体系； crRNA序列为： UA AUUUCUACUAAGUGUAGAUAUCUG GCUGCAUUGCUGCGU； （3） 采用C E‑RAA‑CRISPR方法： 建立CE‑RAA‑CRISPR方法， 下层为RAA反应体系， 中间层用石蜡油分隔， RAA反应结束后， 在管盖内侧中加入CRISPR体系， 通过离心方式进行混合， 然后置于荧光检测仪上， 37 ℃反 应20‑30 min， 每隔30 s进行一次荧 光测定； 所述CRISPR反应体系中含有50~200 nM LbCas12a、 50~200 nM crRNA、 500 nM ssDNA ‑ FQ探针、 2 µL 100 µg/mL BSA溶 液、 2 µL 5M L‑脯氨酸溶 液和2 µL 10×反应Buffer； 所述LbCas12a： crRNA的摩尔比为2:1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752656 B 3