(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210406094.7 (22)申请日 2022.04.18 (71)申请人 武汉科技大 学 地址 430000 湖北省武汉市和平大道 947号 (72)发明人 张同存　张琴星　 (74)专利代理 机构 武汉红观 专利代理事务所 (普通合伙) 42247 专利代理师 赵志汝 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒 载体 拷贝数的方法及其应用 (57)摘要 本发明提出了一种用于检测单个CAR ‑T细胞 的慢病毒载体拷贝数的方法， 包括如下步骤： S1， 以β‑globin为内参基因， 设计β ‑globin的qPCR 引物和探针， 利用β ‑globin的质粒模板建立标 准曲线1； S2， 设计目的基因的引物和探针， 利用 目的基因的质粒模板建立标准曲线2； S3， 分别使 用β‑globin和目的基因的qPCR引物对待测样本 进行PCR扩增， 从标准曲线1上计算出待测样本的 β‑globin拷贝数， 从标准曲线2上计算出待测样 品的CAR拷贝数， 然后根据公式计算出目的基因 相对细胞数的拷贝数。 本发明以β ‑globin为内 源参照基因， 能够稳定且有效地检测出整合入 CAR‑T细胞基因组中整合的病毒载体拷贝数， 且 能够换算成平均每个CAR ‑T细胞基因组 中整合的 病毒载体 拷贝数。 权利要求书2页 说明书12页 序列表4页 附图4页 CN 114686576 A 2022.07.01 CN 114686576 A 1.一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病 毒载体拷贝数的方法， 其特征在于： 包括如下步 骤： S1， 以β‑globin为内参基 因， 设计β ‑globin的qPCR引物和探针， 利用β ‑globin的质粒模 板建立标准曲线1； S2， 设计目的基因的引物和探针， 利用目的基因的质粒模板建立标准曲线2； S3， 分别使用β ‑globin和目的基因的qPCR引物对待测样本进行PCR扩增， 从标准曲线1 上计算出待测样本的β ‑globin拷贝数， 从标准曲线2上计算出待测样 品的CAR拷贝数， 然后 根据公式计算出目的基因相对细胞 数的拷贝数； 目的基因相对细胞 数的拷贝数计算公式为： 2.如权利要求1所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其特 征在于： 所述内参基因β ‑globin的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.1所示； 所述内参基因β ‑globin 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.2所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.3所示， 探针的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.4所示。 3.如权利要求1所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其特 征在于： 所述目的基因元件选自CD3 0 scFv、 WPRE、 HIV ‑1Ψ和RRE中的至少一种。 4.如权利要求3所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其特 征在于： 所述目的基因元件选自CD3 0 scFv和WPRE 。 5.如权利要求4所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其特 征在于： 所述CD30  scFv的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.5， 所述CD30scFv上游引物的核苷酸序 列如SEQ ID:NO.6所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.7所示， 探针的核苷酸序列如 SEQ ID:NO.8所示。 6.如权利要求4所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其特 征在于： 所述WPRE的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.9， 所述CD30  scFv上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID:NO.10 所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID:NO.11所示， 探针的核苷酸序列如SEQ   ID:NO.12所示。 7.根据权利要求4所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其 特征在于： 所述内参基因β ‑globin、 目的基因CD30  scFv和WPRE的探针5 ’端均标记有荧光基 团， 3’端均标记有淬灭基团FA M； 所述荧光基团选自VIC、 FAM、 TET、 HEX、 CY3、 CY5、 Texas  Red、 LC RED640和LC  RED705中的一种。 8.如权利要求1所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法， 其特 征在于： 所述PCR扩增的反应体系： AceQ  qPCR Probe Master Mix15.0 μL、 PF  Primer 20 μM  1.2 μL、 PR  Primer 20 μM 1.2 μL、 Probe  20 μM 0.3 μL、 Sample  5.0 μL、 RNase ‑free Water 7.3 μL、 Total3 0 μL； PCR扩增的反应条件： 95℃， 5mi n； (95℃， 10s； 6 0℃， 30s； )×45。 9.如权利要求1 ‑8任一所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方 法在检测慢病毒载体拷贝数中的应用， 其特征在于： 所述慢病毒载体拷贝数为整合入平均权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114686576 A 2每个CAR‑T细胞基因 组中的慢病毒载体 拷贝数。 10.如权利要求1 ‑8任一所述的一种用于检测单个CAR ‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方 法在检测待测样本中CAR拷贝数的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114686576 A 3