(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210402142.5 (22)申请日 2022.04.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114480694 A (43)申请公布日 2022.05.13 (73)专利权人 北京起源聚禾 生物科技有限公司 地址 102600 北京市大兴区中关村科技园 区大兴生物医药产业基地华佗路50号 院5号楼4层401室 (72)发明人 王林海　刘沛　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 专利代理师 孙艳敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/725(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (56)对比文件 US 2019078142 A1,2019.0 3.14 US 2019078142 A1,2019.0 3.14 WO 2019046 347 A2,2019.0 3.07 WO 93246 59 A1,19 93.12.09 US 2013316922 A1,2013.1 1.28 CN 113348367 A,2021.09.0 3 CN 112301169 A,2021.02.02 CN 113755615 A,2021.12.07 陶址等.阴道微 生态的研究进 展剂临床意 义. 《实用妇产科杂志》 .2018,第34卷(第10期), 第721-723页. 审查员 张丽颖 (54)发明名称 阴道微生态检测引物探 针组合及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种阴道微生态检测引物探 针组合及试剂盒， 所述引物探针组合包含针对卷 曲乳杆菌 （LC） 、 加氏乳杆菌 （LG） 、 詹氏乳杆菌 （LJ） 、 惰性乳 杆菌 （LI） 、 阴道加德纳菌 （GV） 、 念珠 菌属 （CA） 和阴道毛滴虫 （TV） 的靶基因检测引物 和探针， 且探针用于熔解曲线分型。 所述试剂盒 包含引物探针组合。 通过特异性引物和探针组 合， 能够有效扩增上述不同微生物的特异性目标 基因并对其扩增产物进行熔解曲线分析， 可以一 管检测上述七种微生物， 具有高特异性、 耗时短、 灵敏度高、 检测位点覆盖全面等优点， 能够给临 床医生提供辅助诊断参考， 提早进行治疗， 临床 应用广泛。 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图2页 CN 114480694 B 2022.06.17 CN 114480694 B 1.阴道微生态检测引物探针组合， 适用于 高分辨率熔解曲线分析， 其特征在于， 包括针 对卷曲乳杆菌LC、 加氏乳杆菌LG、 詹氏乳杆菌LJ、 惰性乳杆菌LI、 阴道加德纳菌GV、 念珠菌属 CA和阴道毛滴虫TV的靶基因检测引物和探针， 核苷酸序列如下 所示： 卷曲乳杆菌检测引物LC ‑F: SEQ ID NO:1， 卷曲乳杆菌检测引物LC ‑R: SEQ ID NO:2， 卷曲乳杆菌检测探针LC ‑FP: SEQ ID NO:3； 加氏乳杆菌检测引物LG ‑F: SEQ ID NO:4， 加氏乳杆菌检测引物LG ‑R: SEQ ID NO:5， 加氏乳杆菌检测探针LG ‑FP: SEQ ID NO:6； 詹氏乳杆菌检测引物LJ ‑F: SEQ ID NO:7， 詹氏乳杆菌检测引物LJ ‑R: SEQ ID NO:8， 詹氏乳杆菌检测探针LJ ‑FP: SEQ ID NO:9； 惰性乳杆菌检测引物L I‑F: SEQ ID NO:10， 惰性乳杆菌检测引物L I‑R: SEQ ID NO:11， 惰性乳杆菌检测探针L I‑FP: SEQ ID NO:12； 阴道加德纳菌检测引物GV ‑F: SEQ ID NO:13， 阴道加德纳菌检测引物GV ‑R: SEQ ID NO:14， 阴道加德纳菌检测探针GV ‑FP: SEQ ID NO:15； 念珠菌属检测引物CA ‑F: SEQ ID NO:16， 念珠菌属检测引物CA ‑R: SEQ ID NO:17， 念珠菌属检测探针CA ‑FP: SEQ ID NO:18； 阴道毛滴虫检测引物TV ‑F: SEQ ID NO:19， 阴道毛滴虫检测引物TV ‑R: SEQ ID NO:20， 阴道毛滴虫检测探针TV ‑FP: SEQ ID NO:21； 其中， 所述探针的核苷酸序列5 ’端标记荧 光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 还包括内参基因GAPDH的检测引 物和探针， 核苷酸序列如下： GAPDH检测引物:  SEQ ID NO:22~23， GAPDH检测探针: SEQ ID NO:24； GAPDH检测探针的5 ’端标记荧光基团， 3 ’端标记淬灭基团， 且荧光基团与靶基因的检测 探针5’端标记的荧 光基团不同。 3.阴道微 生态检测试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1或2所述的引物探针组合。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括PCR反应液， 所述PCR反应液每一 人份由浓度1U/ μL多重扩增的Taq  DNA聚合酶0.5~1 μL、 浓度10  mM的dNTPs  1~5 μL、 浓度5   mM 的Mg2+ 2~5 μL、 10×DNA聚合酶buf fer 2.5 μL和纯化水补足 15 μL组成。 5.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括细胞裂解液， 所述细胞裂解液由 质量百分含量1%的TritonX ‑100、 0.1%的SDS、 1%的脱氧胆酸钠、 1%的NP ‑40和余量的纯化水 组成。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480694 B 2阴道微生态检测引物探针组合及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测技术领域， 具体涉及 一种用于阴道微生态平衡风险检测的引 物组及试剂盒。 背景技术 [0002]人体女性阴道内环境是指女性阴道腔内所有寄居的微生物群所构成的微生态环 境。 正常情况下， 女性阴道腔内寄居着大量的微生物， 这些微生物在局部微环 境发挥着 重要 的作用， 维持女性阴道健康状态。 已有研究证明， 不同年龄阶段的女性其阴道 微生物存在显 著差异， 表现为在青春期前， 女性阴道菌群的典型特征是低丰度的乳酸杆菌、 阴道加德纳菌 和二路普氏杆菌。 随着青春期的开始， 在雌激素 的刺激下， 阴道上皮再次增厚， 这有利于发 酵葡萄糖的细菌在阴道的定植。 青春期女孩的微生物群与成年女性的阴道微生物组相似， 主要由卷曲乳杆菌、 加氏乳杆菌、 惰性乳杆菌和詹氏乳杆菌组成。 育龄期女性阴道微生物群 以乳酸杆菌为主要优势菌， 同时存在少量的其他厌氧菌， 乳杆菌能通过产酸、 过氧化氢 (H2O2)维持阴道弱酸性环境从而抑制病原菌的生长， 维持阴道正常内环境。 当阴道内的乳杆 菌丰度下降或者乳杆菌功能下降时， 阴道中其他厌氧菌过度增殖， 使 阴道微生态失衡， 导致 内环境紊乱， 可促进女性生殖道外来病原体的定植从而导致局部炎症， 甚至癌症的发生； 同 时， 阴道局部病原体感染可增 加盆腔炎、 早产、 流产等 风险。 [0003]2011年Ravel将396例无症状育龄期女性的阴道菌组进行研究后发现， 女性的阴道 微生物组可以分为5种类型， 其中1～4型以乳杆菌为优势菌， 分别以卷曲乳酸杆菌、 加氏乳 酸杆菌、 詹氏乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌为优势菌群， 而第5型中微生物组呈种类多样化， 无 优势菌， 乳酸杆菌比例降低、 厌 氧菌所占比例大幅上升。 而在这5种类型中， 占比例较高的前 三种依次为： 以卷曲乳酸杆菌为优势菌的类型、 以惰性乳酸杆菌为优势菌的类型、 无优势菌 类型。 也有研究表明存在一种以卷曲乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌共同主导的类型。 阴道微生 态失衡主要是乳酸杆菌减少， 失去优势地位。 细菌性阴道病 （bacterial  vaginosis,  GV） （主要是阴道加德纳菌） 、 滴虫阴道炎 （trichomonal  vaginitis,  TV)、 外阴阴道假丝酵母菌 病 （vulvovaginal  candidiasis,VVC， 也叫念球菌属） 和需氧菌性阴道炎 （aerobic   vaginitis,  AV） 较为常见。 其中混合性阴道炎在近10年的研究中逐渐被妇科重视， 混合性 阴道炎患者阴道微生态平衡严重破坏， 微生态表现更加复杂多样化， 较单一阴道感染诊治 更加困难， 若混合 性感染未 得到及时发现和及时诊 治， 易导致治疗失败和感染反复发作。 [0004]阴道炎的复发也带来很高的经济损失。 20 18年Lancet文献报道， 在高收入国家， 因 VVC复发导致的生产力丧失可带来每年高达14.39亿美元的经济负 担。 因此对阴道炎尤其是 混合性阴道炎及阴道微生态的全面正确认识， 有助于阴道炎症正确诊断和合理治疗， 对防 止混合感染的复发， 改善女性阴道微生态等有重要意义。 因此需要对阴道微生物的种类有 一个清晰的辨别， 能够显著区分感染阴道炎微生物的种类。 目前市场上还没有对应的检测 产品上市， 满足临床需求。说　明　书 1/9 页 3 CN 114480