(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210437353.2 (22)申请日 2022.04.19 (71)申请人 航天中心医院 地址 100049 北京市海淀区玉泉路15号 (72)发明人 梁国威　何美琳　 (74)专利代理 机构 北京维澳专利代理有限公司 11252 专利代理师 隋勤 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6883(2018.01) (54)发明名称 一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因 C677T多态性试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种实时荧光定量PCR检测人 MTHFR基因C677T多态性试剂盒及其应用。 该试剂 盒包括引物组， 引物组包括上游公共引物1条 以 及等位基因特异性引物2条， 等位基因特异性引 物分别为C等位基因特异引物和T等位基因特异 引物。 该试剂盒还包 括SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 试剂。 本申请采用临床常规应用的qPCR技术平 台， 针对人外周血基因组DNA进行检测， 只需要引 物和SYBR  GreenⅠ荧光定量PCR试剂， 无需探针、 高精度温控PCR仪及PCR后续检测等额外附加条 件， qPCR后直接判读结果， 试剂盒具有分型准确、 费用低廉、 高通 量并适合临床常规 开展。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 114717297 A 2022.07.08 CN 114717297 A 1.一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的引物组， 其特征在于， 所述引 物组包括 等位基因特异性引物 2条、 上游公共引物1条， 所述引物组序列为： 上游公共引物： 5 ′ ‑GTC ATC CCT ATT GGC AGG TTA C‑3′； C等位基因特异引物： 5 ′ ‑GCT GCG TGA TGA TGA AAT CTG‑3′； T等位基因特异引物： 5 ′ ‑GCT GCG TGA TGA TGA AAT CTA‑3′。 2.一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒中包 含权利要求1所述的引物组。 3.根据权利 要求2所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的试剂盒， 其 特征在于， 所述试剂盒还 包括SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂。 4.一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法， 其特征在于， 采用SYBR   Green Ⅰ荧光定量PCR试剂， 通过qPCR同时检测两个反应体系， 根据循环阈值的差值判定基 因型； 其中， 两个反应体系包含权利要求1的引物组， 且两个体系分别是C等位基因检测反应 体系和T等 位基因检测反应 体系。 5.根据权利 要求4所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待测人的基因 组DNA； (2)配制C等 位基因检测反应 体系和T等 位基因检测反应 体系； (2)以待测基因组DNA为模板， 分别 进行两个体系的qPCR扩增， 体系， 扩增结束后扩增产 物进行常规熔解曲线分析； (3)结果判读： 根据ΔCt值判定基因型， 或根据qPCR反应曲线直接判断基因型； 根据熔 解曲线判断本次qPCR反应是否为目标片段的特异性扩增产物。 6.根据权利 要求5所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法， 其特 征在于， 20 μL的C等 位基因反应 体系中各物质组成为： SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂10 μl； 上游公共引物1 μl； C等位基 因特异引物1 μl； 灭菌 注射用水6 μl； DNA模板2 μl。 7.根据权利 要求6所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法， 其特 征在于， 20 μL的T等 位基因检测反应 体系中各物质组成为： SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂10 μl； 上游公共引物1 μl； T等位基 因特异引物1 μl； 灭菌 注射用水6 μl； DNA模板2 μl。 8.根据权利 要求7所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法， 其特 征在于， qPCR扩增条件为： 98℃预变性15mi n； 98℃变性10s， 6 0℃退火32s， 40个 循环。 9.根据权利 要求8所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法， 其特 征在于， Δ Ct值＝C引物反应 体系Ct值 ‑T引物反应 体系Ct值。 10.根据权利 要求2‑4任一所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的试 剂盒或根据权利要求5 ‑9所述的实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的方法在 防治新生儿出生 缺陷和/或心 脑血管病中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717297 A 2一种实时荧光定量PCR检测人MT HFR基因C67 7T多态性试剂盒 及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物基因检测技术领域， 特别涉及一种实时荧光定量PC R检测人MTHFR 基因C677T多态性试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因编码的亚甲基四氢叶酸还原酶， 是叶酸 代谢中的关键酶， 叶酸缺乏是新生儿出生缺陷和高同型半胱氨酸血症所致心脑血管病的危 险因素。 MTHFR基因C677T多态性在中国人群中的频率分别约为CC型27％、 CT型49％和TT型 24％， 以野生CC型的MTHFR酶活性为100％， 则杂合CT型的MTHFR酶活性仅约为60％， 突变TT 型的MTHFR酶活性降为30％， 酶活性降低所致叶酸代谢障碍可通过补充叶酸进行纠正。 因 此， 检测MTHFR基因C677T多态性的基因型， 对于防治新生儿出生缺陷和心脑血管疾病尤为 重要， 已逐渐成为临床相关疾病诊 治的常规检测项目。 [0003]目前， MTHFR基因C677T多态性检测试剂盒的方法众多， 包括荧光 ‑PCR探针法、 PCR ‑ 芯片杂交法、 PCR ‑高分辨溶解曲线法、 荧光PCR ‑毛细管电泳测序法、 PCR ‑金磁微粒层析法、 PCR‑荧光探针熔解法等。 在上述方法中， 荧光 ‑PCR探针法需要设计探针， 该探针增加了试剂 盒成本； PCR ‑高分辨溶解曲线法需要高精度温控荧光定量PCR仪器， 检测 仪器要求高， 不具 有普适性； 荧光PCR ‑毛细管电泳测序法、 PCR ‑金磁微粒层析法则需要额外设备和操作； 而 PCR‑荧光探针熔解法需要设计探针增加试剂盒成本， 因此， 现有的试剂盒或多或少 存在成 本高、 检测仪器温控精度要求高或需要后续检测设备、 步骤等 缺陷。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题 是提供一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T 多态性试剂盒及其应用， 其采用临床常规应用的qPCR技术平台， 针对 人外周血基因组DNA进 行检测， 只需要引物和SYBR  GreenⅠ荧光定量PCR试剂， 无需探针、 高精度温控PCR仪及PCR后 续检测等额外附加条件， qPCR后直接判读结果， 试剂盒具有分型准确、 费用低廉、 高通量并 适合临床常规 开展等特点。 [0005]本发明所要解决的技 术问题是通过以下技 术方案来实现的： [0006]一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的引物组， 所述引物组包括 等位基因特异性引物 2条、 上游公共引物1条， 所述引物组序列为： [0007]上游公共引物： 5 ′ ‑GTC ATC CCT ATT GGC AGG TTA C‑3′； [0008]C等位基因特异引物： 5 ′ ‑GCT GCG TGA TGA TGA AAT CTG‑3′； [0009]T等位基因特异引物： 5 ′ ‑GCT GCG TGA TGA TGA AAT CTA‑3′。 [0010]一种实时荧光定量PCR检测人MTHFR基因C677T多态性的试剂盒， 所述试剂盒中包 含上述的引物组。 [0011]优选地， 上述 技术方案中， 所述试剂盒还 包括SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂。说　明　书 1/7 页 3 CN 114717297 A 3