(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210411188.3 (22)申请日 2022.04.19 (71)申请人 中国科学院水生 生物研究所 地址 430000 湖北省武汉市东湖南路7号 (72)发明人 陶彬彬　张西娅　宋焱龙　罗红瑞　 陈戟　胡炜　 (74)专利代理 机构 武汉宇晨专利事务所(普通 合伙) 42001 专利代理师 龚莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 5/075(2010.01) C12N 15/89(2006.01)G01N 15/14(2006.01) A01K 61/10(2017.01) A01K 61/95(2017.01) (54)发明名称 一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合 性腺的检测方法 (57)摘要 本发明属于水产动物遗传育种技术领域， 公 开了一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合 性腺的检测方法。 本发明建立了黄鳝原始生殖细 胞活体荧光标记、 流式细胞仪分选荧光细胞、 生 殖细胞缺失受体鱼制备以及幼鱼期黄鳝生殖细 胞移植的技术方法， 并根据黄鳝生殖细胞特异表 达的dazl基因的3’ ‑UTR区域设计PCR引 物， 通过 两轮PCR可在黄鳝生殖细胞极少的条件 下扩增出 目的片段， 高灵敏度地鉴定出受体 鱼性腺中是否 存在定植的黄鳝生殖细胞。 本发 明提供的方法简 单高效， 灵敏度高， 可有效应用于利用 “借腹生 殖”技术生产黄鳝配子的早期检测， 在黄鳝 “借腹 生殖”技术的开发及解决黄鳝苗种短缺的产业问 题方面有重要的应用前 景。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114592075 A 2022.06.07 CN 114592075 A 1.一种黄鳝 生殖细胞异种移植及移植后嵌合 性腺的检测方法， 包括下述 步骤： 1)注射可阻断鲤鱼或斑马鱼 dnd mRNA翻译的morpholino  至鲤鱼或斑马鱼受精卵， 将 生殖细胞剔除的鲤鱼或斑马鱼幼鱼作为黄鳝 生殖移植的受体鱼； 2)注射活体荧光标记至1细胞期黄鳝胚胎， 挑选带有荧光标记的黄鳝胚胎； 选取卵黄后 方的胚胎组织， 利用含有0.05~0.3%胶原蛋白酶V和0.5 ‑2%柠檬酸钠的Ringer平衡 盐溶液对 剪去的黄鳝胚胎组织消化， 每间隔10~30分钟用5ml、 10ml或20ml无菌注射器轻轻吹打2~10 次， 酶消化总时间不超过2小时， 利用孔径70μm或100μm细胞筛滤去未解离的组织块， 2000rpm离心3~8分钟， 用含有胎牛血清的PBS溶液重悬细胞后用40 μm或70 μm细胞筛再次过 滤后保留滤液， 并在显微镜下观察确认滤液是否为外观完整的单细胞悬液； 利用流式细胞 仪对符合要求的单细胞悬液进 行荧光分选， 获得的GFP阳性细胞即为黄鳝原始 生殖细胞， 将 黄鳝原始生殖细胞通过玻璃针注射到到内源生殖细胞剔除的鲤鱼或斑马鱼幼鱼性腺原基 处， 获得嵌合黄鳝 生殖细胞的受体鱼； 3)提取黄鳝 生殖细胞移植后1~12月龄的受体鲤鱼或斑马鱼性腺总RNA， 逆转录为cDNA； 4)以步骤3） 得到的cDNA为模板， 通过巢式PCR扩增黄鳝生殖细胞特异表达 的dazl基因 序列； PCR巢式PCR第一轮的引物为eel ‑dazl‑F1： 5’ ‑AGTATGCCCTCCTTTCTCCT ‑3’, eel‑ dazl‑R1： 5’ ‑AATTGATGCCTTGATTGTCC ‑3’； 第二轮PCR以第一轮PCR反应的产物为模板， 引物 序列： eel ‑dazl‑F2： 5’‑CAGAGCACCCTCACCATACC ‑3’, eel‑dazl‑R2 ： 5’‑   GAATAGCCGAAAGCCCTTAT  ‑3’； 第一轮PCR后扩增得到的黄鳝 dazl片段为744bp,第二轮PCR后扩增得到的黄鳝 dazl片 段为355bp； 表明受体鱼性腺中存在整合的黄鳝 生殖细胞。 2.根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 方 法 ，所 述 的 鲤 鱼 m o r p h o l i n o 为 ：5 ’‑ cctgctgta gctgctgtc cctccat‑3’； 斑马鱼的morpho lino为： 5’ ‑gctgggcatccatgtctc cgaccat‑3’。 3.根据权利 要求1所述的方法， 步骤2） 中含有胎牛血清的PBS中， 胎牛血清和 PBS的体积 比是2%。 4.权利要求1所述的方法在黄鳝商业养殖中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592075 A 2一种黄鳝生殖细胞异种移 植及移植后嵌合性腺的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于水产动 物遗传育种技术领域， 更具体涉及一种黄鳝生殖细胞异种移植 及移植后嵌合性腺的检测方法。 采用本方法可对黄鳝生殖细胞异种移植后的定植成功率进 行检测。 适用于 黄鳝“借腹生殖 ”技术的开发， 以及异种生产黄鳝成熟配子的早期检测。 背景技术 [0002]鱼类生殖细胞移植技术是指将从供体鱼得到的生殖细胞植入受体鱼,获得生殖系 嵌合体鱼并产生源自供体的配子或后代,也可称为鱼类 “借腹生殖 ”技术。 2003年， 日本研究 人员将虹鳟(Oncorhynchus  mykiss)的原始生殖细胞(p rimordial germ cell,PGC)成功移 植到樱鳟(Oncorhynchus  masou)体内(Takeuchi  et al.,2003),首次实现鱼类的 “借腹生 殖”。 2006年， 将分离纯化的虹鳟A型精原干细胞(A ‑SG)移植到同种异体的受体 鱼中， 获得来 源于供体鱼的功能性雌雄配子(Okutsu  et al.,2006)， 标志着生殖细胞移植技术获得重要 突破。 目前该项技术已在多种淡海水鱼类中获得成功， 通过移植鲤鱼生殖干细胞至金鱼 (Franek et al.,2021)、 泥鳅生殖干细胞至斑马鱼(Saito  et al.,2008)、 稀有鮈鲫生殖干 细胞至斑马鱼(Zhang  et al.,2021)、 大菱鲆生殖干细胞至牙鲆(Zhou  et al.,2021)， 获得 供体鱼来源的鲤鱼、 泥鳅、 稀有鮈鲫及大菱鲆成熟配子 。 [0003]黄鳝(Monopterus  albus)是我国水产养殖重要的名特优对象。 黄鳝雌雄同体、 先 雌后雄的性反转特性， 导致雌性亲鳝通常因个体小而怀卵量少， 雄性成熟亲鳝较少， 而且人 工繁殖时， 需解剖雄性亲鳝 获得性腺后才能得到配子， 导致人工繁殖黄鳝不仅难度大， 而且 成本很高， 养殖苗种主要依靠野生捕捞， 但仅依靠野生捕捞难以满足黄鳝产业对于苗种的 需求， 因此苗种短缺一直是制约其养殖产业 发展的瓶颈。 将黄鳝生殖细胞移 植到怀卵量大、 性成熟周期短的受体 鱼中， 建立成熟的黄鳝生殖细胞移 植技术流程， 实现黄鳝 “借腹生殖 ”， 有望生产出 大量的黄鳝卵或精子， 进 而解决黄鳝产业发展的苗种短缺 瓶颈。 [0004]就鱼类生殖细胞移植的技术而言， 首先， 需要建立供体鱼的生殖干细胞有效分离 技术， 且分离操作需要保持生殖干细胞的活性， 以获得可用于移植的供体细胞。 其次， 需要 制备生殖细胞缺失或三倍体不育鱼作为移植受体； 最后， 需要建立高效的移植后的嵌合性 腺检测方法。 [0005]供体与受体鱼亲缘关系的远近决定生殖细胞移植的成功与否。 目前鱼类生殖细胞 移植技术在不同科间、 属间、 种间或种内获得成功， 但尚未见不同目间鱼类生殖细胞移 植的 成功案例。 在分类上， 黄鳝属于合鳃目、 合鳃科， 黄鳝属， 合鳃目中鱼的种类较少， 且这些鱼 类不符合作为移植受体鱼应具有的怀卵量大或性成熟周期短的特 征。 [0006]因此开展黄鳝生殖细胞移植研究需要解决不 同目间生殖细胞移植的难题。 此外， 进行黄鳝生殖细胞移 植研究需要分离获得具有活性的黄鳝生殖干细胞， 如何对黄鳝原始 生 殖细胞进行活体标记并分离纯化获得具有活性的黄鳝原始生殖细胞是需要解决的另一难 题。 酶消化对细胞会造成损伤， 针对不同的物种用到的酶和酶浓度是不一样的， 同一物种不 同研究论文中报道也有不同的情况(Goto  et al.,2010； Zhang  et al.,2020)， 未见黄鳝消说　明　书 1/6 页 3 CN 114592075 A 3