(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210419120.X (22)申请日 2022.04.20 (71)申请人 首都医科 大学附属北京朝阳医院 地址 100000 北京市朝阳区工人体 育场南 路8号 申请人 北京华诺奥美 基因生物科技有限公 司 (72)发明人 陈牧雷　高元丰　杨莹莹　杨新春　 魏星　王培佳　魏婕　曹晔萱　 刘圆　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01)C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库 构建方法及试剂盒 (57)摘要 本发明属于基因突变检测技术领域， 公开了 一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库 的构建方法和试剂盒。 本发明所述构建方法和试 剂盒基于多重PCR扩增子测序技术， 涉及LDLR、 APOB、 PCSK9、 LDLRAP1四个单基因突变， 以及 家族 性高胆固醇血症相关多基因位点12个位点： rs2479409； rs629301； rs1367117； rs4299376； rs1564348； rs1800562； rs3787354； rs11220462； rs8017377； rs6511720； rs429386； rs7412， 能够 兼容于多种测序平台， 同时具有建库步骤简洁、 成本节约和应用范围广等诸 多优势。 权利要求书2页 说明书19页 序列表61页 附图1页 CN 115232860 A 2022.10.25 CN 115232860 A 1.一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： S1、 第一轮多重PCR反应： 包括T1反应管体系、 T2反应管体系和T3反应管体系； 所述T1反 应管体系包括第一引物池和第一反应液； 所述T2反应管体系包括第二引物池和第二反应 液； 所述T3反应管体系包括第三引物池和第三反应液； 所述第一引物池包括86对引物， 86对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ  ID  NO.1‑SEQ ID NO.172所示； 所述第二引物池包括87对引物， 87对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ  ID  NO.173‑SEQ ID NO.346所示； 所述第三引物池包括15对引物， 15对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ  ID  NO.347‑SEQ ID NO.377所示； S2、 多重PCR反应合并： 选取T1反应管体系运行PCR扩增反应， 获得反应产物A； T2反应管 体系运行PCR扩增反应， 获得反应产物B； 选取T3反应管体系运行PCR扩增反应， 获得反应产 物C； 将上述反应产物 A、 反应产物B与反应产物C混合 合并， 获得合并产物； S3、 磁珠纯化合并产物； S4、 第二轮序列PCR反应、 第二轮 磁珠纯化及文库浓度测量与质检， 完成文库构建。 2.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特 征在于， 所述T1反应管体系体积为10 ‑12.5 μL； 所述T2反应管体系体积为10 ‑12.5 μL； 所述T3反应管体系体积为1 ‑5 μL。 3.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特 征在于， 所述第二轮序列PCR反应 体系体积为3 0‑40 μL。 4.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特 征在于， 所述多重PCR反应合并中， 在制备合并产 物时的反应产 物A、 反应产 物B与反应产 物C 体积分别为1 1.5 μL、 13.5 μL和5 μL。 5.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特 征在于， 所述第一反应液包括Enhancer  buffer NB缓冲液、 Enhancer  buffer M缓冲液、 IGT‑EM808酶混合液、 gDNA和d dH2O； 所述第二反应液包括Enhancer  buffer NB缓冲液、 Enhancer  buffer M缓冲液、 IGT ‑ EM808酶混合液、 gDNA和d dH2O。 6.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特 征在于， 第三反应液包括IGT ‑GC Buffer缓冲液、 IGT ‑GC Enhancer缓冲液、 IGT ‑GC dNTP、 Enhancer buffer NB缓冲液、 IGT ‑GC Polymerase聚合酶、 gDNA和d dH2O。 7.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法， 其特 征在于， 所述磁珠 纯化合并产物中， 磁珠 纯化处理流程为： 向合并产物加入磁珠， 混匀、 室温孵育、 移除上清、 加入YF  buffer B混匀、 二次室温孵 育、 移除上清、 加入乙醇溶液， 静置、 加入Nuclease ‑free water， 重悬磁珠， 室温静置、 吸取 上清液， 转移到新的PCR管内， 管内上清液为 合并后的多重PCR产物。 8.根据权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232860 A 2其特征在于， 所述第二轮磁珠纯化处理流程为： 向PCR反应体系内加入磁珠， 混匀、 室温孵 育、 移除上清、 加入Y F buffer B， 混匀、 二次室温孵育、 静置、 加入 Nuclease ‑free water或1 ×TE buffer(pH  8.0)， 混匀、 重悬磁珠、 吸取上清液， 转移到新的PCR管中， 管中上清为制备 好的多重PCR文库。 9.一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测试剂盒， 其特征在于， 其包含上述权利要 求1‑8任一所述的构建方法中的T1反应管体系 、 T2反应管体系和T3反应管体系。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232860 A 3