(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210422671.1 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 南京鼓楼医院 地址 210008 江苏省南京市 鼓楼区中山路 321号 (72)发明人 杨平　李智洋　徐志鹏　 (74)专利代理 机构 南京禾祁专利代理事务所 (普通合伙) 32462 专利代理师 黄天天 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种真菌微生物组作为胃癌诊断的标志物 的应用 (57)摘要 本发明公开了一种真菌微生物组作为胃癌 诊断的标志物的应用， 所述的真菌微生物组选自 真菌中门水平、 属水平以及种水平中的一种或以 上。 通过对GC组织、 癌旁组织和健康(HC)胃组织 进行真菌DNA的ITS测序和读数的分类 学注释， 总 共生成450万个有效标签， 分成了1631个分类单 元(OTUs)， 鉴定到了10个门水平和301个属水平 的真菌亚群。 GC组中Basidiomycota与 Ascomycota的比例增加， 同时GC中高表达的 Cystobasidium,Cutaneotrichosporon,Apodus, Apiotrichum,Simplicillium,Lecanactis, Rhizopus ,Rhodotorula ,Exophiala , Sarocladium可以作为胃癌诊断 的真菌微生物组 标志物， 并且与胃癌的发生和发展密切相关。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图5页 CN 114807417 A 2022.07.29 CN 114807417 A 1.一种真菌微生物组作为胃癌诊断的标志物的应用， 其特征在于， 所述真菌微生物组 包含Cystobasidium,Cutaneotrichosporon,Apodus,Apiotrichum,Simplicillium, Lecanactis,Rhizopus,Rhodotorul a,Exophi ala和Sarocladium中的任意一种或几种的组 合， 其中， 真菌微 生物为真菌中门水平、 属水平以及种水平中的一种或以上。 2.权利要求1所述的标志物的应用， 其特征在于， 所述真菌微生物的筛选方法为： 通过 提取组织中的DNA， 进行ITS测序和读数分类学注释， 判断胃癌患者与健康对照之间的所述 真菌微生物的差异度和/或相似性， 得到真菌微 生物标志 物。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述组织包括胃癌组织、 癌旁组织和健康 胃组织。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 所述 ITS测序的过程 为： (1)提取组织中的DNA； (2)使用ITS引物进行建库和PCR扩增； (3)使用NanoDrop  2000紫外分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的浓度 和纯度； (4)利用I llumina MiSeqPE 300测序仪进行测序。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 步骤(2)中的ITS引物为： 上游引物ITS3F： GCATCGATGA AGAACGCAGC， 下游引物ITS4R： TC CTCCGCTTATTGATATGC 。 6.根据权利要4所述的应用， 其特 征在于， 所述的读数分类学注释过程 为： (1)删除错配、 缺失和重复的序列， 只允许2个核苷酸 错配； (2)使用UPARSE.7将相似性97％以上的分类单 元(OTU)聚集为相同OT U； (3)使用Q IIME计算α 多样性， 包括c hao1、 物种和P D_whole_tree； (4)使用LefSe 方法对GC和H C组差异表达的真菌进行分析。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 使用受试者工作曲线ROC分析真菌标志物， 分析工具为Excel和Graphpad  8.0。 8.一种用于胃癌诊断的试剂 盒， 其特征在于， 包含能够检测出权利要求1所述的标志物 所属真菌的试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807417 A 2一种真菌微生物组作 为胃癌诊断的标志物的应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物组或胃癌技术领域， 具体涉及 一种真菌微生物组作为胃癌诊断 的标志物的应用。 背景技术 [0002]胃癌(GC)是最常见的恶性肿瘤之一， GC在所有与癌症相关的死亡病例中排名第 二， 是第五大最广泛诊断的癌症。 GC的发展通常经过萎缩性胃炎(AG)到肠化生(IM)， 最 终发 展为GC的多个过程。 虽然胃癌的病因和发病机制尚不清楚， 但已证实暴露于环境致癌物质 (如有毒化学物质和幽门螺杆菌)会增加 癌症风险， 菌群也可通过改变其自身的组成和基因 表达以应对不断变化的环境条件。 胃一直被认为是细菌的 “敌对场所 ”， 因为强酸性的胃液 不适合微生物生长。 最近的证据 表明， 胃中微生物种群的改变与胃癌的发病和进展有关。 自 20世纪80年代至今， 幽门螺杆菌(H.pylori， HP)被发现是13年来最常见的胃癌致病细菌。 然 而所有感染HP的案例中， 最终只有1 ‑3％的患者会发展为GC； 同时， 有15％的HP患者通过药 物根除HP后仍然发展为GC， 这表明其他微生物也可以寄生在胃中并在GC的发生和发展中发 挥作用 [0003]高通量测序技术的进步为探索健康人和胃癌患者胃中微生物组成和丰度差异提 供了有力的技术保障。 一项研究证明， 口腔细菌更有可能聚集在胃癌样本中， 链球菌、 奈瑟 菌、 嗜血杆菌和卟啉单胞菌是GC中最占优势的菌种。 新出现或重新出现的真菌正在成为世 界范围内与宿主的免疫调节密切相关的公共卫生威胁。 最近的研究证实了结直肠腺瘤组 织、 克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中真菌成分的改变， 为 发现宿主‑真菌微生物组相互作用 之间的新关系提供了机会。 然而， 理解胃真菌微生物群在GC中的功能作用的研究很少， 特别 是从真菌在GC 筛查中的潜在诊断价 值的角度。 [0004]我国是GC大国， 目前GC的筛查仍依赖于胃镜检查： 操作复杂， 体验差， 依从性低。 GC 的临床血清标志物主要有CA19 ‑9、 CEA和CA72 ‑4等， 然而这些血清标志物对GC的敏感性和特 异性不高。 即血清学肿瘤指标正常， 但部 分肿瘤患者已经发展到较晚的阶段， 甚至患者出现 肿瘤的复发和转移， 但肿瘤指标仍 维持在正常水平。 因此， 寻找新的灵敏度和特异 性更高的 标志物是解决胃癌 患者早期诊断并提供及时治疗建议的有效途径。 发明内容 [0005]发明目的： 本发明通过全面分析了GC组织、 GC癌旁组织和健康胃组织中的真菌微 生物组， 对胃中真菌微生物组的变化与GC发生 发展的关系做出了解释 。 结果显示， GC患者胃 部菌群特别是Basidiomycota的丰度显著高于HC组， GC组中10种高丰度的真菌属可以作为 GC预测和诊断的标志物。 进一步的， 首次提出了宿主真菌微生物群与GC发生发展的相互作 用， 为真菌在GC中的潜在作用提供了新的解释。 [0006]基于上述发明目的， 本发明公开了一种真菌微生物组作为胃癌诊断的标志物的应 用， 所述真菌微生物组包含Cystobasidium,Cutaneotrichosporon,Apodus,Apiotrichum,说　明　书 1/4 页 3 CN 114807417 A 3