(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210419587.4 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 江苏农林职业 技术学院 地址 212400 江苏省镇江市句容市文昌东 路19号 (72)发明人 杨剑波　庄林林　朱孟玲　施一成　 吴井生　宋春雷　孙丽　谢海强　 赵彬　任希艳　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 柏尚春 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、 检测 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的扩 增引物对、 检测试剂盒及应用， 所述扩增引物对 基于非洲猪瘟病毒B646L基因特异性保守区域 设 计， 包括正向引物和反向引物； 所述正向引物序 列如SEQ ID NO： 1所示， 所述反向引物序列如SEQ   ID NO： 2所示； 本发明所述试剂盒由病毒核酸快 速扩增试剂组成。 病毒核酸快速扩增试剂包括含 有石墨烯的反应缓冲液、 非洲猪瘟病毒B646L基 因快速扩增引物和质控品。 利用荧光定量PCR仪， 本方法可在30分钟内完成非洲猪瘟病毒荧光定 量检测。 本发明非洲猪瘟病毒检测方法操作简 便、 安全， 灵敏度高、 特异性强、 重复性好， 有利于 实际应用。 权利要求书1页 说明书8页 附图6页 CN 114672596 A 2022.06.28 CN 114672596 A 1.扩增引物对， 其特征在于： 所述扩增引物对基于非洲 猪瘟病毒B646L基因特异性保守 区域设计， 包括正向引物和反向引物； 所述正向引物序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述反向引 物序列如SEQ  ID NO： 2所示。 2.根据权利要求1所述的扩增引物对， 其特征在于： 所述正向引物和反向引物的摩尔比 为1： 1‑1： 2。 3.权利要求1或2所述的扩增引物对在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。 4.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于:所述试剂盒含有权利要求1或2所述 的扩增引物对。 5.根据权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒的结果判断方式为采用荧光 检测； 所述荧光检测为在反应液中加入核酸荧光 染料， 所述核酸荧光染料为SYBR  Green I、 Eva Green或SYTO  9中的一种。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 所述荧光检测为扩增引物对的正、 反向 引物上标记有特定标记物， 两种标记物相互靠近可激发或淬灭荧光， 所述特定标记物为 FITC、 FAM、 H EX、 ROX、 Cy3、 Cy5、 TAMRA、 DabcyI、 BHQ2或BHQ3中的两种或几种。 7.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还包括石墨烯、 扩增缓冲液、 Bst DNA聚合酶、 dNTPs、 聚乙二醇、 甜菜碱、 无酶水、 阳性对照和阴性对照。 8.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 所述石墨烯为氧化石墨烯、 还原石墨烯、 磁性石墨烯、 多孔石墨烯、 石墨烯纳米管或者以石墨烯为表层的微纳米材 料中的一种。 9.根据权利要求7或8所述的试剂盒， 其特征在于： 所述石墨烯添加量为0.2ng/μL ‑ 1.2ng/ μL。 10.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 所述扩增引物对反应温度为两步温度 快速循环， 第一步为辅助变性温度， 温度为70～74℃， 第二步温度为扩增反应温度， 温度为 60～65℃， 反应时间均为1～10秒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672596 A 2一种检测非洲猪瘟病毒 的扩增引物对、 检测试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物， 具体涉及基于非洲猪瘟病毒 B646L基因的扩增引物对、 检测试剂盒及应用。 背景技术 [0002]非洲猪瘟 是由非洲猪瘟病毒(Afr ican swine fever virus， ASFV)引起的急性、 烈 性、 高度接触性的传染病， 给全球养猪业带来了巨大的威胁。 该传染病属于世界动物卫生组 织(OIE)的法定报告动物疫病， 也是中 国规定的一类动物疫病。 非洲猪瘟病的特征是发病过 程短， 最急性和急性 感染死亡率高达100％， 临床表现为发热(40～ 42℃)， 心跳加快， 呼吸困 难， 部分咳嗽， 眼、 鼻有浆液性 或粘液性脓性分泌物， 皮肤 发绀， 淋巴结、 肾、 胃肠粘膜明显出 血。 针对非洲猪瘟病毒的检测和防控防范一直是全社会关注的重点。 目前非洲猪瘟病缺 乏 有效的治疗手段和防控疫苗， 建立快速、 灵敏的诊断方法对于非洲猪瘟病的防控至关重要。 [0003]目前， 国内外检测非洲猪瘟病毒方法主要有以下几种： (1)病毒分离鉴定结合红细 胞吸附试验。 这是目前非洲猪瘟病毒检测的 “金标准”， 该方法结果准确， 但操作烦琐、 耗费 时间长， 且只能检测样本中具有感染能力的病毒颗粒， 因此灵敏度不 足， 不利于感染的早期 诊断。 (2)免疫 学检测方法。 以酶联免疫吸附试验为代表的免疫 学检测方法也是目前实验室 检测常用的非洲猪瘟病毒检测方法， 但该方法具有滞后性， 检测步骤冗繁， 灵敏度和特异 性 也有待提高。 (3)病毒核酸检测。 应用最为广泛的是聚合酶链 式反应(PCR)技术。 常规PCR检 测结果的判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳， 耗时较长， 且需使用含有一定毒性的核酸染料 等试剂， 操作安全性有待提高。 实时荧光定量PCR可以对靶标进行快速定量检测且无需电 泳， 但由于 仪器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。 [0004]根据目前已公开的文献或专利中基于核酸扩增的检测技术包括荧光定量PCR、 环 介导等温扩增、 纳米PCR、 重组酶聚合酶扩增及其衍生技术。 这些方法要么检测所需时间较 长， 要么对 靶序列及长度有一定的要求， 且引物设计有一定限制。 [0005]因此， 本领域亟需开发一种检测时间短、 能够精准检测、 适用于基层 检测机构及养 殖现场检测的病毒 核酸检测方法。 这对于有效防控ASFV具有极其重要的意 义。 发明内容 [0006]发明目的： 本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对。 [0007]本发明还提供 所述扩增引物对在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。 [0008]本发明最后提供一种检测时间短、 灵敏度高、 特异性强、 适用性广的检测非洲猪瘟 病毒的试剂盒及检测方法。 [0009]技术方案： 本发明提供的扩增引物对基于非洲猪瘟病毒B646L基因特异性保守区 域设计， 包含正 向引物和反向引物； 所述正向引物序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述反向引物 序列如SEQ  ID NO： 2所示。 [0010]所述扩增引物基于非洲猪瘟病毒B646L基因特异性保守区域设计， 具体如下：说　明　书 1/8 页 3 CN 114672596 A 3