(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210426209.9 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 北京积水潭医院 地址 100000 北京市西城区新 街口东街31 号 申请人 北京华诺奥美 基因生物科技有限公 司 (72)发明人 邓微　兰玲　苟默　周美岑　魏星　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、 试剂盒及其使用方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测BRAF基因突变的引 物探针组合物、 试剂盒及其使用方法和应用， 属 于基因检测技术领域。 这种引物探针组合物包括 检测BRAF基因突变位点c.1919A＞C 的实时荧光 PCR引物和检测探针， 实时荧光PCR引物包括SEQ   ID No.1～2所示的氨基酸序列； 检测探针包括 SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。 这种试剂盒能 够快速、 准确的体外检测人全血样本中BRAF基因 NM_001374258.1转录本上的c.1919T>A致病变 异。 检测结果可用于甲状 腺乳头状癌、 结直肠癌、 黑色素瘤的辅助诊断。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114634987 A 2022.06.17 CN 114634987 A 1.一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物， 其特征在于， 所述引物探针组合物包括 检测BRAF基因突变位 点c.1919 A＞C的实时荧 光PCR引物和检测探针； 所述实时荧 光PCR引物包括SEQ  ID No.1～2所示的氨基酸序列； 所述检测探针包括SEQ  ID No.3所示的氨基酸序列。 2.根据权利要求1所述检测BRAF基因突变的引物探针组合物， 其特征在于， 所述探针为 Taqman探针， 所述Taqman探针的5 ’端标记有荧 光报告基团， 3 ’端标记有荧 光淬灭基团； 所述荧光报告基团包括FAM、 Cy5、 ROX、 VIC和NED中的任一种； 所述荧光淬灭基团包括 MGB、 NFQ、 QSY、 MGB和BHQ1中的任一种。 3.根据权利要求2所述检测BRAF基因突变的引物探针组合物， 其特征在于， 所述荧光报 告基团为VIC； 所述 荧光淬灭基团为MGB。 4.一种检测BRAF基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1～3任一 项所述的引物探针组合物。 5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 针对人类CFTR基因保守序列特异性的内参引物和内参探针； 所述内参引物包括SEQ  ID No.4～5所示的的核苷酸序列； 所述内参探针包括SEQ  ID  No.6所示的 的核苷酸序列。 6.根据权利 要求5所述的检测BRAF基因突变的试剂盒， 其特征在于， 所述 内参探针的5 ’ 端标记有荧 光报告基团， 3 ’端标记有荧 光淬灭基团； 所述内参探针的荧 光报告基团与所述检测探针的荧 光报告基团不同； 优选地， 所述内参探针的荧 光报告基团为 NED， 所述内参探针的荧 光淬灭基团为MGB。 7.一种根据权利要求4～6任一项所述的试剂 盒以非疾病 诊断和/或治疗为目的的使用 方法， 其特 征在于， 其包括： 提取待测样本的基因组， 使用所述试剂盒对所述待测样本的基因组进行扩增， 检测荧 光信号， 将荧 光信号的阈值限设置为0.15， 分析Ct值。 8.根据权利要求7 所述的使用方法， 其特 征在于， 所述扩增的程序包括： 预变性： 95℃、 3 0sec， 1个 循环； 循环扩增： 95℃、 10sec， 6 0℃、 30sec； 所述循环扩增的次数为 45次。 9.一种根据权利要求4～6任一项所述的试剂盒在制备BRAF基因突变相关的癌症诊断 试剂中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述癌症包括甲状腺乳头状癌、 结直肠癌 和黑色素瘤。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114634987 A 2一种检测BRAF基因 突变的引物探针组合物、 试剂盒及其使用 方法和应用 技术领域 [0001]本发明属于基因检测技术领域， 具体涉及一种检测BRA F基因突变的引物探针组合 物、 试剂盒及其使用方法和应用。 背景技术 [0002]BRAF错义变异发生于近8％人类肿瘤中， 主要发生于甲状腺乳头状癌、 结直肠癌和 黑色素瘤中。 [0003]甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤， 是危害女性健康的十大癌种之一。 因 此， 给社会、 家庭和个人 带来的负担正在不断加重 。 [0004]目前， 甲状腺细针穿刺活检术(fine  needle aspiration biopsy， FNAB)被认 为是 鉴别良恶性甲状腺结节的最精确 检查。 研究表明， 行FNAB后经细胞病理学检查， 其中5％为 恶性， 60％～70％为良性， 10％～30％为不确定或可疑恶性， 对这些不确定或可疑恶性病例 进行术后病理检查， 发现仅20％～25％为甲状腺癌， 故有75％～80％的患者接受不必要的 手术。 因此， 如何正确处 理FNAB无法鉴别的病例， 是目前临床医师面临的困难。 发明内容 [0005]本发明针对现有技术的缺陷， 提供一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物、 试 剂盒及其使用方法和 应用。 这种试剂盒能够快速、 准确的体外检测人全血样本中BRAF基因 NM_001374258.1转录本上的c.1919T>A致病变异。 检测结果用于甲状腺乳头状癌、 结直肠 癌、 黑色素瘤的辅助诊断。 [0006]本发明通过以下技 术方案实现： [0007]第一方面， 本发明提供一种检测BRAF基因突变的引物探针组合物， 所述引物探针 组合物包括检测BRAF基因突变位 点c.1919 A＞C的实时荧 光PCR引物和检测探针。 [0008]这种引物探针组合物可以特异 性的检测BRAF:NM_001374258.1:exon 15: c.1919T >A:p.Val640Glu位点突变， 即检测人全血样本中BRAF基因  NM_001374258.1转录本上的 c.1919T>A致病变异， 该变异的致病性明确。 [0009]实时荧光PCR引物包括SEQ  ID No.1～2所示的核苷酸序列； [0010]所述检测探针包括SEQ  ID No.3所示的核苷酸序列； [0011]具体地， 该引物探针组合物的序列如下： [0012]BRAF 引物序列(5'‑‑3') 序号 Mut‑F TGGATCCAGACAACTGTTCAAACT SEQ ID No.1 Mut‑R TGAAGACCTCACAGTA AAAATAGGTGAT SEQ ID No.2 Mut‑P 报告基团 ‑CATCGAGAT TTCTCT‑淬灭基团 SEQ ID No.3 [0013]进一步地， 在本发明较佳 的实施例中， 所述探针为Taqman探针， 所述  Taqman探针 的5’端标记有荧 光报告基团， 3 ’端标记有荧 光淬灭基团；说　明　书 1/7 页 3 CN 114634987 A 3