(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210421710.6 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区文苑路1 号 (72)发明人 尹绍武　李谣　杨智茹　程景颢　 李杰　张国松　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 孙斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种精准检测长吻鮠低氧胁迫下摄食率的 特异性引物及其试剂盒和方法 (57)摘要 本发明公开了一种精准检测长吻鮠低氧胁 迫下摄食率的特异性引物及其试剂盒和方法， 所 述特异性引物包括长吻鮠NPY和/或CC K基因特异 性实时荧光定量PCR引物对。 本发明设计的特异 性引物通过实时荧光定量PCR检测NPY和/或CCK 基因的相对表达量来判断长吻鮠低氧胁迫下摄 食率变化， 当NPY和/或CCK基因相对表达量较对 照组出现极显著差异时(P＜0.01)， 长吻鮠不再 摄食， 所以本发 明检测长吻鮠低氧胁 迫下的摄食 率仅根据NPY和/或CC K基因表达量较对照组是否 出现及显著差异(P＜0.01)即可精确判断， 该检 测方法具有稳定性好、 实用性强、 操作 简单、 准确 率高等优点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114774560 A 2022.07.22 CN 114774560 A 1.一种精确检测长吻鮠低氧胁迫下摄食率的特异性引物， 其特征在于， 包括长吻鮠NPY 和/或CCK基因特异性实时荧 光定量PCR引物对： NPY‑F： 5′ ‑CACGACGCACAGCATCAC ‑3′； NPY‑R： 5′ ‑AGCACAAACACGCCACAA‑3′。 CCK‑F： 5′ ‑ACACGATGC CAACACCCG‑3′； CCK‑R： 5′ ‑TCCAGCCCAAGTAGTCCC‑3′。 2.一种用于精确检测长吻鮠低氧胁迫下摄食率的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要 求1所述的特异性引物。 3.一种采用权利要求1所述的特异性引物或者权利要求2所述的试剂盒快速检测长吻 鮠摄食率的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 将低氧处理后待检测长吻鮠脑组织总RNA的 提取与纯化， 进 行cDNA第一链的合 成、 利用特异性引物对长吻鮠cDNA进行实时荧光定量PCR 检测。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR扩增反应体系优选 为Faststart  Universal  SYBR Green Master 10 μL， 2mol/ μL的正 反特异性引物各0.45 μL， ddH2O 7.1 μL， 5ng/ μL的cDNA模板2 μL。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR扩增反应程序为95 ℃ 5min， 1个循环； 95℃  10s， 60℃ 30s， 40个循环， 4℃保存。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR检测为基因的相对 表达量检测， NPY和/或CCK基因表达量反映了长吻鮠在低氧胁迫下摄食率的变化， 当NPY基 因和CCK基因相对表达量较对照组出现极显著差异时(P＜0.01)， 长吻鮠不再摄食。 7.一种长吻鮠NPY和/或CCK基因在精确检测长吻鮠低氧胁迫下摄食率中的应用， 所述 NPY和CCK基因序列如SEQ  ID NO.1‑2所示。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述长吻鮠NPY和/或CCK基因相对表达量 精确检测判断长吻鮠低氧胁迫下摄食率变化。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述NPY基因相对表达量降低和/或CCK基 因相对表达量升高精确检测判断长吻鮠低氧胁迫下摄食率变化。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774560 A 2一种精准 检测长吻鮠 低氧胁迫下摄食率的特异性引物及其试 剂盒和方 法 技术领域 [0001]本发明属于水产养殖技术领域， 具体涉及 一种精准检测长吻鮠低氧胁迫下摄食率 的特异性引物及其试剂盒和方法。 背景技术 [0002]长吻鮠(Leiocassis  longirostris)隶属于鲇形目(Siluriformes)、 鲿科 (Bagridae)、 鮠属(Leiocassi s)， 是我国特色经济鱼类， 主要分布于中国东部的长江、 辽河、 淮河、 闽江至珠江等水系， 以天然的小鱼小虾 为适口饵料， 主要 特点是肉质鲜美， 营养丰富， 深受广大消费者喜爱。 [0003]食欲调控是一个复杂的过程， 它由中枢神经系统和外周神经系统共同调节。 鱼类 通过下调促食基因和上调抑食基因的表达来调控摄食行为， 机体的食欲调节因子被分为两 大类： 促进食欲基因(Ghrelin和NPY等)、 抑制食欲(POMC、 PYY、 CCK、 Leptin和NUCB2等)。 NPY 已被证实是一种调控摄食的内源性促食因子， 其主要作用是增加食物的摄入， 降低饱食动 物的产热效应， CCK是一个餐后饱腹感信号因子， 能够减少摄食量， 缩短摄食时间和增加饱 腹感， 其在 食欲调控中起着 重要作用。 目前关于鱼类食欲的研究主要集中摄食率、 消化率和 食欲调节因子的基因克隆等方面， 如齐口裂腹 鱼、 草鱼、 金鱼、 团头鲂、 西伯利亚鲟、 牙鲆等， 针对长吻鮠摄食率与食欲基因表达 关系的研究鲜有报道。 尽管在生产实践中也能通过投喂 统计出鱼类的摄食率， 但由于养殖规模 大， 鱼类数量不确定， 很难找到池塘中鱼类的最大摄 食量而无法准确统计， 并且面临操作繁琐、 费时、 成本较高等突出问题。 因此， 亟需一种新的 方法检测长吻鮠摄食率的变化。 [0004]实时荧光定量PCR技术是在常规PC R技术的基础上发展起来的核酸定量技术。 实时 荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃， 而且与常规PCR相比， 实时荧光PCR技术 具有灵敏度高、 特异 性高、 可定量、 有效解决P CR污染问题及自动化程度高等优点， 已广泛应 用于分子生物学和医学研究等领域。 随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发， 近年来， 实时 荧光PCR技术在动物基因检测中也得到 了广泛的应用。 发明内容 [0005]发明目的： 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种精准检测长吻鮠低氧胁 迫下摄食率的特异性引物； 利用该特异性引物结合荧光RT ‑PCR技术可快速、 精准地对长吻 鮠低氧胁迫下摄食率进行检测。 [0006]本发明还提供了用于精确检测长吻鮠低氧胁迫下摄食率的试剂盒及其检测方法。 [0007]技术方案： 为了实现上述目的， 本发明所述一种精确检测长吻鮠低氧胁迫下摄食 率的特异性引物， 包括长吻鮠NPY和/或C CK基因特异性实时荧 光定量PCR引物对： [0008]NPY‑F： 5′ ‑CACGACGCACAGCATCAC ‑3′； [0009]NPY‑R： 5′ ‑AGCACAAACACGCCACAA‑3′。说　明　书 1/5 页 3 CN 114774560 A 3