(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210429231.9 (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属同济 医院 地址 430030 湖北省武汉市解 放大道1095 号 (72)发明人 陈丽婷　周剑峰　顾佳　肖敏　 曹阳　黄亮　 (74)专利代理 机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 专利代理师 胡镇西　冯超 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组及其 微滴式数字PCR试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测粪便中人巨细胞病 毒的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒。 本发 明基于人巨细胞病毒保守的AD169 基因组中编码 即刻早期转录调节蛋白的基因序列设计特异性 引物及MGB水解探针， 从而得到微滴式数字PCR试 剂盒， 本发明通过提取粪便上清游离DNA和微滴 式数字PCR试剂盒检测粪便中人巨细胞病毒的拷 贝数， 对辅助临床诊断患者是否患有CMV肠炎的 疾病有重要指导 意义。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114622040 A 2022.06.14 CN 114622040 A 1.一种检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组， 其特征在于： 所述PCR引物组由引物对 CMV‑FR和探针C MV‑P1组成， 其中， 所述引物对C MV‑FR为 上游引物C MV‑F1： 5’ ‑GTGATCCATGTGCT TATGACTTTGT‑3’， 下游引物C MV‑R1： 5’ ‑GCCTTGGTCACGGGTGTCT‑3’； 所述探针CMV ‑P1： 5’ ‑ATCATGTGTTTAGGCCC ‑3’， 且探针CMV ‑P1的5’端标记有荧光基团， 其3’端标记有非荧 光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组， 其特征在于： 所述荧光 基团为FAM， 所述非荧 光淬灭基团为MGB。 3.一种检测粪便中人巨细胞病毒的微滴式数字PCR试剂盒， 其特征在于： 所述PCR试剂 盒包括权利要求1所述PCR引物组。 4.根据权利 要求3所述微滴式数字PCR试剂盒， 其特征在于： 所述微滴式数字PCR试剂盒 还包括数字PCR缓冲液、 微 滴生成油、 微 滴生成卡、 96孔板和铝箔热封膜。 5.根据权利要求3或4所述的微滴式数字PCR试剂盒， 其特征在于： 所述PCR试剂盒还包 括内控基因引物组(根据针对编 码人核糖核蛋白复合体亚基基因POP4设计得到)， 所述内控 基因引物组由内控引物对POP4 ‑FR和内控探针POP4 ‑P， 其中， 所述内控引物对POP4 为包括 上游引物POP4 ‑F： 5’ ‑GGCGGTGGTCCTGGAGTACT‑3’， 下游引物POP4 ‑R： 5’ ‑AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT‑3’； 所述内控探针POP4 ‑P： 5’ ‑ACCCGCCACAAGC ‑3’， 且内控探针引物POP4 ‑P的5’端标记有荧 光基团。 6.一种权利要求3～5任意一项所述的微滴式数字PCR试剂 盒检测人巨细胞病毒核酸的 方法， 其特 征在于， 至少包括以下步骤： 1)处理粪便标本， 提取粪便上清 游离DNA； 2)配制微滴式数字PCR反应混合液： 将所述微滴式数字PCR检测试剂和待测样本DNA模 板混合， 得到微 滴式数字PCR反应混合液； 3)微滴生成： 将所述微滴式数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中， 置于 微滴生成仪中生成微 滴； 4)PCR扩增反应： 将所述生成的微滴转移到96孔板中， 盖上铝箔膜， 封膜机进行封膜， 封 完膜将96孔板放入PCR仪进行PCR扩增反应； 5)读取荧光信号： 将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中， 设置好参数， 利用软件直接进 行结果读取和分析。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤3)中， 生成微 滴的方法如下： 将微滴式数字PCR反应混合液加入到微滴发生板内， 然后在对应的其它孔内加入微滴 发生油， 再将微滴生成板置入微滴 发生卡内， 盖上皮套， 放入微滴 发生仪中自行进 行微滴发 生。 8.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 所述步骤4)中， 所述微滴式数字PCR反应混 合液的体系如下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114622040 A 22x ddPCR Supermix 10 μL 上游引物C MV‑F1 1 μL 下游引物C MV‑R1 1 μL 探针CMV‑P1 2 μL 上游引物POP4 ‑F 1 μL 下游引物POP4 ‑R 1 μL 探针POP4 ‑P 2 μL DNA样本 2 μL 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 所述步骤4)中， PCR扩增反应的条件为： PCR 扩增： 95℃条件下保温5min， 然后95℃ 保温30s、 60℃ 保温1min， 共进行40个循环； 最后在98 ℃条件下保温10mi n,降温至4℃保温。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114622040 A 3