(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210428999.4 (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 南昌富泰力诺 检测应用系统有限公 司 地址 330052 江西省南昌市南昌县小蓝经 济技术开发区汇仁 大道266号15栋 申请人 力德力诺生物技 术 （北京） 有限公司 (72)发明人 张鸿　曾建华　何庆华　李金卿　 (74)专利代理 机构 天津知川知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 12249 专利代理师 胡翠 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/53(2006.01)G01N 33/543(2006.01) G01N 21/76(2006.01) G01N 33/535(2006.01) G01N 33/533(2006.01) G01N 33/577(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶促 化学发光均相免疫检测方法中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种金刚烷胺抗原模拟表位及 其在磁微粒酶促化学发光均相 免疫检测方法中 的应用， 其氨基酸序列为： SVYNALYLAASE， 将该抗 原模拟表 位多肽与荧光素酶进行融合表达， 生物 合成多肽 ‑荧光素酶融合蛋白， 将融合蛋白作为 传统的化学合成的金刚烷胺半抗原 ‑荧光素酶偶 联物的替代物应用于免疫分析中， 建立磁微粒酶 促化学发光均相免疫检测金刚烷胺的方法， 该方 法具有操作简单、 成本低廉、 灵敏度高、 绿色环保 等特点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114989257 A 2022.09.02 CN 114989257 A 1.一种基于多肽的金刚烷胺抗原模拟表位， 其氨基酸序列为： SVYNALYLA ASE。 2.编码权利要求1所述 抗原模拟表位的核苷酸序列。 3.编码权利要求1所述抗原模拟表位的核苷酸序列， 5 ’ ‑3’： AGCGTGTATAACGCGCTGTATC TGGCGGCGAGCGA A。 4.基于权利要求1所述抗原模拟表位在金刚烷胺磁微粒酶促化学发光均相免疫检测中 的应用， 其特 征在于： 包括下述 步骤： 将抗原模拟表位多肽与荧 光素酶进行偶联， 制备多肽 ‑荧光素酶偶联物； 将金刚烷胺单 克隆抗体与磁微粒进行偶联制备磁微粒 ‑抗体偶联物； 将多肽‑酶偶联物、 磁微粒 ‑抗体偶联物置 于PBS缓冲液中作为核心检测元件； 具体检测步骤： 投入多肽 ‑酶偶联物、 磁微粒 ‑抗体偶联物、 待测样本提取液于反应管 中， 37℃孵育反应后用磁力架将 磁微粒吸附于管壁， 将反应管中的溶液弃去后， 在管中加入 荧光素酶的底物液进 行发光值测定； 若样本中不含有 金刚烷胺， 则磁微粒 ‑抗体偶联物将全 部与多肽 ‑酶偶联物进行结合， 形成磁微粒 ‑抗体‑多肽‑酶复合物， 加入底物后其发光值最 大； 若样本中含有金刚烷胺， 则磁微粒 ‑抗体将吸附待测样本中的金刚烷胺， 形成部分磁微 粒‑抗体‑金刚烷胺复合物， 磁微粒 ‑抗体‑多肽‑酶复合物的形成量将减少， 而游离在液相中 的多肽‑酶复合物将增多并随后从反应管中弃去， 从而导致管中的发光值降低， 管中的发光 值随着投入的金刚烷胺含量增大而逐步降低， 形成定量反应曲线， 进而可获知据具体待测 样本中的金刚烷胺含量。 5.权利要求4所述检测方法中使用的多肽 ‑荧光素酶偶联物， 其特征在于： 为金刚烷胺 抗原模拟多肽与荧 光素酶的融合蛋白。 6.权利要求5所述多肽 ‑荧光素酶偶联物的制备方法， 其特征在于： 采用基因工程重组 表达的方式， 将抗原模拟表位多肽的基因序列通过柔性linker与纳米荧光素酶基因连接， 克隆至原核表达载体， 表达融合蛋白获得。 7.权利要求4所述检测方法中使用的磁微粒， 其特征在于： 由磁性内核及包覆其内核外 表面的外壳组成， 直径范围为10 0‑2000nm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114989257 A 2金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微 粒酶促化学发光均相免疫 检测方法中的应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种金刚烷胺抗原模拟表位及其在磁微粒酶 促化学发光均相免疫检测方法中的应用。 背景技术 [0002]金刚烷胺(Am antadine,AMD)属于三环胺类， 最早是一种抑制流感病毒的人用抗病 毒药， 但在养殖业中也被用于预防和治疗禽流 感、 猪流感等疾病。 由于其在人体内的蓄积性 与能使病毒产生耐药性的特点， 中国农业部已明令禁止金刚烷胺作为兽药使用。 目前常用 的金刚烷胺检测方法主要为仪器检测方法如高效液相色谱法、 气相色谱法、 液相色谱 ‑质谱 联用法等。 这些方法虽然在检测灵敏度、 特异 性和稳定性等方面各有优势， 但 也普遍存在耗 时、 繁琐、 测试费用高等缺点。 免疫学分析方法因其具有特异性强、 灵敏度高且适合大规模 筛查等优点， 在农、 兽药残留的快速检测领域发挥着重要作用。 现有的免疫分析方法包括 ELISA、 胶体金免疫层析 试纸条、 FRET均相检测法等。 [0003]磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法是一种将磁性分离技术、 酶促化学发光技 术、 免疫分析技术三者结合起来的一种分析方法， 其检测小分子物质的原理是： 将半抗原与 酶偶联为半抗原 ‑酶， 同时制备抗体与磁微粒的偶联物， 将两种偶联物与待测样本 混合孵育 反应。 当待测样本中不含靶标物质时， 溶液中形成 “磁微粒‑抗体‑半抗原‑酶”复合物， 将反 应液置于磁场中后 “磁微粒‑抗体‑半抗原‑酶”会吸附于反应管壁， 弃去管中溶液后加入底 物液， 酶触发底物发光且此时的发光值最大； 当待测样本中含有靶标物质时， 靶标会竞争结 合磁微粒 ‑抗体， 使形成的 “磁微粒‑抗体‑半抗原‑酶”复合物减少， 而形成的磁微粒 ‑抗体‑ 靶标复合物增加， 将反应物置于磁场作用后， “磁微粒‑抗体‑半抗原‑酶”复合物将固定于 反 应管壁， 而 溶液中的游离的磁微粒 ‑抗体‑靶标复合物被弃去， 加入底物液后， 由于 “磁微粒‑ 抗体‑半抗原‑酶”复合物量减少， 其 发光值将会降低， 并且其降低的量与加入的待测靶标量 呈现反向线性关系， 从而实现定量检测。 该方法具有无需洗板、 检测时间短、 线性范围宽等 优点。 [0004]磁微粒酶促化学发光均相免疫检测方法中半抗原 ‑酶偶联物的制 备至关重要。 然 而传统的半抗原 ‑酶偶联物的制备主要通过化学合成的方法直接将半抗原与酶通过化学修 饰的方法进行制备， 存在着批次误差大、 步骤繁琐、 成本高且易造成环境污染等诸多问题。 此外， 由于半抗原 ‑酶偶联物是直接使用待测的半抗原为原料， 因此在竞争免疫分析过程 中， 其与天然半抗原和抗体的竞争能力是一样的， 进而会影响反应体系的灵敏度和线性范 围。 [0005]基于噬菌体展示多肽技术， 可以通过生物淘选的方式， 以抗体为配体， 投入噬菌体 展示多肽库， 获得特异性结合抗体的多肽分子， 该多肽分子具备与天然半抗原竞争结合对 应抗体的属性， 并能应用于免疫分析 领域， 该多肽分子即为 抗原模拟表位。说　明　书 1/5 页 3 CN 114989257 A 3