(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210428547.6 (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 广东梁氏水产种业有限公司 地址 528100 广东省佛山市三水区西南 街 道青岐竹洲路口5号 (72)发明人 韩林强　黄景军　梁健辉　吴勇亮　 晏书唤　李烨然　林士杰　谢泽文　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 斑鳢雌性分子标记引物及其应用、 鉴别斑鳢 性别的方法 (57)摘要 本发明属于斑鳢性别鉴定技术领域， 具体涉 及斑鳢雌性分子标记引物及其应用和鉴别斑鳢 性别的方法。 本发明提供的斑鳢雌性分子标记引 物， 包括引物对BLX 1和/或引物对BLX2 。 本发明提 供的引物对能特异性鉴别斑鳢性别， 配合雄性分 子标记可对斑鳢超雄鱼YY型和正常雌雄鱼XX型 或XY型进行快速准确地鉴定， 能够提高斑鳢鱼全 雄性或全雌性育种效率。 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图3页 CN 114836543 A 2022.08.02 CN 114836543 A 1.一种斑鳢雌性分子标记引物， 其特 征在于， 包括引物对BLX1和/或引物对BLX2； 所述引物对B LX1包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的上游引物Contig ‑1‑F和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.2所示的下游引物Co ntig‑1‑R； 所述引物对B LX2包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物Contig ‑2‑F和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.4所示的下游引物Co ntig‑2‑R。 2.权利要求1所述的引物在斑鳢全雄 性或全雌性育种中的应用。 3.权利要求1所述的引物在斑鳢性别鉴定中的应用。 4.一种斑鳢性别鉴定的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 利用权利要求1所述的引物对待测斑鳢的基因组DNA进行PCR扩增， 对PCR扩增产物进行 检测； 当能够扩增出DNA片段时， 检测的斑鳢为雌性X X型或者正常雄性XY型； 当不能扩增出DNA片段时， 检测的斑鳢为超雄鱼Y Y型。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系以20μL计， 包括： 斑鳢的基因组DNA20～50ng， 10 μM的上游引物和下游引物各0.8 μL， 2 ×TaqPlus MasterMix   II 10 μL和余 量的ddH2O。 6.根据权利要求4或5所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的程序为： 94℃预变性 2min； 94℃变性3 0s， 55℃退火3 0s， 72℃延伸2mi n， 35个循环； 72℃终延伸5mi n。 7.根据权利4所述的方法， 其特征在于， 利用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳对 所述PCR扩增产物进行检测。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 当利用引物对BLX1检测PCR扩增时， 所述扩 增片段的长度为243bp； 当利用引物对BLX2检测PCR扩增时， 所述扩增片段的长度为628bp。 9.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 采用柱式离心法提取所述待测斑鳢的基因 组DNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836543 A 2斑鳢雌性分子标记引物及其应用、 鉴别斑 鳢性别的方 法 技术领域 [0001]本发明属于斑鳢性别鉴定技术领域， 具体涉及斑鳢雌性分子标记引 物及其应用、 鉴别斑鳢性别的方法。 背景技术 [0002]斑鳢(Channa  maculata)属鳢科、 鳢属鱼类， 为淡水底层鱼类， 多栖息于沿岸水草 和淤泥底质浅水区。 斑鳢是典型的肉食性鱼类， 幼鱼主要以桡足类、 一些鱼类仔鱼和水生昆 虫幼虫等为食， 成鱼则以各种小 型杂鱼为食， 包括鲤鱼和鲮鱼等， 人工饲养可以投喂配合饲 料， 在土塘或者水泥池等进行高密度养殖。 斑鳢肉质白嫩、 肉味鲜美、 肉感爽口、 营养丰富， 经济价值高。 [0003]研究表明乌鳢和斑鳢均属于XY性别决定型， 要规模化生产出全雄斑鳢或全雄斑乌 杂交鳢商品苗种， 需要构建斑鳢YY繁育系， 大量生产YY雄性。 而构建斑鳢YY繁育系， 需要解 决两个关键步骤， 第一步是在雌性化诱导子代中将XY生理雌性个体从XX生理雌性中筛选出 来， 第二步则需要从XY生理雌性与XY雄性后代 中将YY雄鱼从XX雌性和XY雄性中筛选出来。 尽管此前有雄性Y分子标记开发成功， 能够解决第一步面临的问题， 筛选出XY生理雌性个 体。 但在第二步中Y标记无法区分正常XY雄性和YY超雄鱼， 而用传统测交的方法既耗时又费 力， 不适合大规模筛选YY超雄鱼， 需要开发稳定可靠的雌性X分子标记筛选， 从而筛选其中 的YY超雄鱼。 迄今为止， 国内外虽有能够成功 鉴定斑鳢遗传性别的分子标记的报道， 但是主 要是单核苷酸多态 性标记， 实际使用比较困难。 因此， 开 发一种简 便且能准确鉴定斑鳢是否 含X染色体 基因的遗传性别的分子标记， 在斑鳢全雄育种中具有极大的生产应用价 值 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供斑鳢雌性分子标记引 物及其应用、 鉴别斑鳢性别的方法， 在分子水平上鉴别斑鳢性别， 筛选出斑鳢YY繁育系超雄鱼， 提高检测结果的准确性， 提高斑 鳢鱼全雄 性育种效率。 [0005]本发明提供了一种斑鳢雌性分子标记引物， 包括引物对BLX1和/或引物对BLX2； [0006]所述引物对BLX1包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的上游引物Contig ‑1‑F和核 苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示的下游引物Co ntig‑1‑R； [0007]所述引物对BLX2包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物Contig ‑2‑F和核 苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的下游引物Co ntig‑2‑R。 [0008]本发明还提供了上述的引物在斑鳢全雄 性或全雌性育种中的应用。 [0009]本发明还提供了上述的引物在斑鳢性别鉴定中的应用。 [0010]本发明还提供了一种斑鳢性别鉴定的方法， 包括如下步骤： [0011]利用上述的引物对待测斑鳢的基因 组DNA进行PCR扩增， 对PCR扩增产物进行检测； [0012]当能够扩增出DNA片段时， 检测的斑鳢为雌性X X型或者正常雄性XY型； [0013]当不能扩增出DNA片段时， 检测的斑鳢为超雄鱼Y Y型。说　明　书 1/7 页 3 CN 114836543 A 3