(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210430405.3 (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 山东农业大 学 地址 271000 山东省泰安市岱宗大街61号 (72)发明人 武玉叶　张晓　王海莲　张华文　 王岳萍　刘树兵　 (74)专利代理 机构 北京中知慧专利代理事务所 (普通合伙) 11969 专利代理师 卜爱华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种高粱籽 粒单宁基因Tannin2内的等位变 异体tan2-d及其分子标记和应用 (57)摘要 本发明提供了调控高粱籽粒单宁有无基因 Tannin2编码区内一个功能性等位变异体， 在第 八外显子处一个碱基的突变(C/T)， 命名为tan2 ‑ d变异类型。 这个功能性等位变异导致高粱籽粒 单宁缺失； 根据这个功能性等位变异开发的用于 高通量标记分子标记 检测的KASP分子标记， 具有 灵活、 高效、 高通量、 低成本等优点。 KASP分子标 记可以高效检测这种变异在高粱品种中的分布 状况， 筛选含有及不含有这种等位变异的高粱种 质资源， 用于进行作物改良； 同时还可 以在育种 群体中进行标记辅助选择， 选育含有或者不含单 宁的高粱新品种， 选育用于酿酒、 新型能源开发、 食品及饲料等 不同用途的高粱新品种。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图2页 CN 114752699 A 2022.07.15 CN 114752699 A 1.一种高粱籽粒单宁基因Tannin2内的新功能性等位变异体tan2 ‑d， 其特征在于： 所述 等位变异体的核苷酸序列在Tannin2编码区+1366位点处存在一个C/T的突变， 所述突变导 致Tannin2基因编码的蛋 白在456aa处的密码子由CAG变为TAG， 编码终止密码子， 导致翻译 提前终止， 不编码HLH结构域， 从而造成Tan nin2基因功能的丧失。 2.一种tan2 ‑d的KASP高通量SNP标记， 其特征在于： 所述分子标记包括2条正向引 物， 1 条反向引物； 标记 tan2‑d‑KASP的引物序列如下： Tan2‑d‑KASP‑FAM C‑Tan2: 5'GGAGAGCGC CGCCGGTCC 3'， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； Tan2‑d‑KASP‑HEX T‑tan2‑d: 5'GGAGAGCGC CGCCGGTCT 3'， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； Tan2‑d‑KASP‑R: 5'GCATGACGA ACCTCTCATTGAGC 3'， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示。 3.一种tan2 ‑d的KASP高通量SNP标记在检测Tannin2基因编码区导致中国高粱单宁有 无发生改变的关键SNP变异的应用。 4.一种tan2 ‑d的KASP高通量SNP标记在检测Tannin2基因编码区导致中国高粱单宁有 无发生改变的关键SNP变异的应用， 其特征在于： 利用分子标记和提取的基因组DNA进 行PCR 扩增， 并在荧光信号检测系统上进 行SNP检测； 判定的标准以点的颜色和聚集在横轴或纵轴 的位置决定： 信号为红色， 聚集在纵轴附近且与tan2 ‑d对照聚集在一起， 判定为tan2 ‑d基因 型； 信号为蓝色， 与横轴和野生型Tan nin2对照聚集在一 起， 判定为Tan nin2基因型。 5.一种tan2 ‑d的KASP高通量SNP标记在高粱单宁 育种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752699 A 2一种高粱籽粒单宁基因Ta nnin2内的等位变异体ta n2‑d及其 分子标记和应用 技术领域 [0001]本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域， 具体涉及一种高粱籽粒单宁基因 Tannin2内的等 位变异体tan2 ‑d及其分子标记和应用。 背景技术 [0002]高粱(Sorghum  bicolor L.Moench)是世界第五大禾谷类作物， 也是中 国最早栽培 的禾谷类作 物之一。 高粱在世界上分布很广， 主要在非洲、 亚洲和美洲的干旱和半干旱地区 种植， 对高温， 干旱和盐碱等极端环境具有良好的耐受性。 高粱主要作为食物、 饲料、 酿造和 生物燃料等种植。 在我国， 高粱生产 的经济意义和国家需求主要体现在杂粮食品、 酿酒工 业、 饲料工业、 色素工业和生物质能源等几个方面。 高粱曾是中国北方地区的主要粮食作 物， 近年来种植面积锐减。 一方面原因是随着工业经济飞速发展， 国内饮食结构发生变化； 另一方面则是高粱籽粒的营养品质低， 适口性差。 具体表现为单宁含量偏高， 淀粉结构欠 佳、 氨基酸组成不平衡。 [0003]高粱谷物富含营养成分和有益健康的酚类化合物， 单宁是高粱中含量最多的多酚 物质之一。 高粱单宁在功能的开发利用上具有双重性， 一方面， 单宁含有涩味， 作为饲料时 可以与蛋白质、 碳水化合物、 酶和金属离子等结合形成难以消化吸收的复合物， 还会降低一 些消化酶的活性， 从而影响蛋白质的消化吸收， 降低了饲料的营养价值。 另一方面单宁作为 一种天然抗氧化剂， 具有降低氧化胁迫和防治心脑血管疾病等功 能； 另外酿酒的发酵过程 中产生的多酚类物质和特殊 芳香化合物， 对酒的 口感和品质具有直接影响。 [0004]基于以上特点， 食用及饲用高粱要求单宁含量较低， 而酿造高粱则需要较高的单 宁含量， 这就对不同用途高粱的育种选择提出了明确要求。 因此鉴定并利用控制单宁形成 基因培育具有不同单宁含量的品种是高粱籽粒 单宁含量改良的最经济有效的途径。 [0005]原花青素(pr oanthocyanidin,PA)又叫缩合单宁(condensed  tannin,CT),是高等 植物特有并广泛存在的聚多酚类化合物， 以PA单体、 寡聚物或多聚物的形式存在。 在高粱 中， 单宁主要存在于籽粒的外种皮的单宁层中， 由于单宁层通常呈棕色或紫色， 因此籽粒的 果皮呈现棕色。 经典遗传学和连锁研究通过种子颜色及外种皮层的有 无鉴定了一些控制高 粱籽粒颜色及多酚化合物的位点。 禾谷类作物单宁形成、 调控等分子基础的研究还处于初 始阶段， 除Tannin1和Tnnin2基因外， 其他与单宁合成有关的基因还未被鉴定， 更缺乏用于 有无单宁育种选择的高通 量分子标记。 发明内容 [0006]通过QTL精细作图技术， 已经图位克隆了位于高粱第2号染色体上的QTL， 将 其命名 为Tannin2， 将含有单宁的高粱与不含单宁的高粱Tannin2基因测序并进行序列比对， 发现 Tannin2在+8018位点、 +7777位点、 +8031位点的三个功能性等位变异位点， 造成Tannin2编 码的氨基酸序列发生了变化， 是造成部 分高粱品种单宁丧 失的根本原因。 但是， 我们在 对大说　明　书 1/9 页 3 CN 114752699 A 3