(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210435826.5 (22)申请日 2022.04.24 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区 邰 城路3号 (72)发明人 秦虎强　王丽　黄丽丽　刘巍　 王娜娜　 (74)专利代理 机构 西安汇恩知识产权代理事务 所(普通合伙) 6124 4 专利代理师 毕波 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引 物及其检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种猕猴桃黑点病菌可视化 检测的LA MP引物， LAMP引物包 括正向引物FIP、 反 向引物BIP、 正向引物F3、 反向引物B3、 正向引物 Loop F、 反向引物Loop  B， 核苷酸序列依次如SEQ   ID NO:1～6所示。 还提供了检测方法， 提猕猴桃 果实果皮的DNA， 建立LAMP反应体系， 将LA MP反应 体系用矿物油封住液面后， 在温度为65℃的条件 下等温反应45min进行扩增， 反应结束后加入10 ×SYPR Green I染料； 反应液呈荧光 绿色表示含 猕猴桃黑点病菌， 呈褐色表示不含猕猴桃黑点病 菌。 本发明具有特异性强、 灵敏度高、 操作过程简 单、 检测成本低， 能够有效地检测和预防猕猴桃 黑点病菌。 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 附图1页 CN 114752700 A 2022.07.15 CN 114752700 A 1.一种猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物， 其特征在于， 所述LAMP引物包括正向 引物FIP、 反 向引物BIP、 正向引物F3、 反 向引物B3、 正向引物Loop  F、 反向引物Loop  B； 所述 正向引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述反向引物BIP的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:2所示， 所述正向引物F3的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示， 所述反向引物B3的核苷酸序 列如SEQ ID NO:4所示， 所述正向引物Loop  F的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示， 所述反 向 引物Loop B的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 2.一种用权利要求1所述的猕猴桃黑点病菌可视化检测的LAMP引物进行猕猴桃黑点病 菌检测的方法， 其特 征在于， 该 方法为： S1、 提猕猴桃果实果皮的DNA， 得到待检测基因 组DNA； S2、 用S1中得到的待检测基因组DNA建立LAMP反应体系， 将所述LAMP 反应体系用矿物油 封住液面后， 在温度为65℃的条件下等温反应45min进行扩增， 反应结束后加入10 ×SYPR  GreenI染料； 反应液 呈荧光绿色表示含猕猴桃黑 点病菌， 呈褐色表示 不含猕猴桃黑 点病菌； 所述LAMP反应体系为： 10 ×Isothermal  Amplific ation Buffer 2.5 μL、 100mmol ·L‑1 的MgSO4溶液0.5 μL、 10mmol ·L‑1的dNTPs溶液3.5 μL、 10 μmol ·L‑1的正向内引物FIP  4.0 μL、 10 μmol·L‑1的反向内引物BIP  4.0 μL、 10 μmol ·L‑1的正向外引物F3  0.5 μL、 10 μmol ·L‑1的 反向外引物B30.5μL、 10μmol ·L‑1的正向引物Loop  F 1.0μL、 10μmol ·L‑1的反向环引物 Loop B 1.0 μL、 8U·μL‑1的Bst DNA聚合酶溶液1.0 μL、 4mol ·L‑1的甜菜碱1μL、 待检测基因 组DNA1 μL， d dH2O补足至25 μL。 3.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述矿物油的用量为30μL， 所述10 ×SYPR  GreenI染料的用量 为1 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752700 A 2一种猕猴桃黑 点病菌可视化检测的LAMP引物及其检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于猕猴桃 黑点病菌检测技术领域， 具体涉及一种猕猴桃黑点病菌可视化 检测的LAMP引物及其检测方法。 背景技术 [0002]翠香猕猴桃属美味猕猴桃品系， 因其品质优良、 口感香甜、 具有早熟优质、 上市早、 收益高等优点， 近些年来逐渐成为陕西省猕猴桃主要的栽培品种。 自2013年起， 陕西周至县 的‘翠香’猕猴桃果园连年发生黑点病， 平均病园率达85.8％， 病果率达48.5％以上。 作者 2018年和2019年8月在我省猕猴桃 主栽区周至县、 眉县田间病果调查结果， 翠香品种平均病 园率达100％， 平均病 株率达85.7％， 平均病果率达25.65％， 严重园80％以上。 该病害其病 原为间座壳属真菌(有性态)Diaporthe  phaseolorum， 是近年在陕西猕猴桃生产中新出现 的一种重大果 实病害， 该病害在陕西各猕猴桃主产区均有发生， 危害连年严重， 发病品种以 翠香最为严重， 其次为徐香品种， 发病较轻； 其田间发病时期为每年7月上旬始发病， 七月下 旬至八月上旬达到发病高峰， 主要危害果实， 发病症状表现为： 在果皮表面造成黑褐色疮 痂， 发病初期果 实下部表皮部 分出现黑褐色小斑点， 而后病斑逐渐扩 大， 发病严重时病斑连 成一片呈疮痂状， 表皮硬化、 表皮绒毛坏死； 病斑主要集中在果实下半部， 通过解剖观察发 现， 病斑仅危害果 实表皮， 果肉未见明显变化， 发病果 实易脱落、 变软腐烂， 不耐贮藏、 运输， 商品性、 食用性及经济价值显著下降， 由此给果农造成巨大的经济损失， 已成为备受关注和 严重危害猕猴桃产业的重大病害。 [0003]猕猴桃黑点病的致病菌为喜高温、 高湿的弱寄生真菌， 可在土壤、 植物体和病残体 上潜伏越冬， 当环境条件适宜时快速繁殖、 发病， 而致病菌在侵染的初期阶段是防治的关 键， 其防治成本低且防效最理想， 但由于该病菌在潜伏期病症表现不明显、 不易观察， 因此 很难判断是否感染， 从而错过了最佳的防治时期， 影响防治措施和防治效果； 同时， 通过田 间采样测定， 明确田间菌源量大小和当年病害发生动态及病原鉴定， 可为该病害的预测预 报和及时制定防治 策略提供依据。 因此， 病害田间的无症带菌状态的早期诊断十 分必要， 是 掌握病情发展阶段的重要依据， 也是猕猴桃黑点病防治的关键。 但目前尚未见到有关针对 猕猴桃黑 点病菌的快速检测技 术方法研究资料或专利报道。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足， 提供一种猕猴桃 黑点 病菌可视化检测的LAMP引物及其检测方法， 该方法具有特异性强、 灵敏度高、 操作过程简 单、 检测成本低， 能够有效地检测 和预防猕猴桃黑 点病菌。 [0005]为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是： 一种猕猴桃黑点病菌可视化检 测的LAMP引物， 所述LAMP引物包括正向引物FIP、 反向引物BIP、 正向引物F3、 反向引物B3、 正 向引物LoopF、 反 向引物Loop  B； 所述正向引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述 反向引物BIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示， 所述正向引物F3的核苷酸序列如SEQ  ID 说　明　书 1/3 页 3 CN 114752700 A 3