(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210451299.7 (22)申请日 2022.04.24 (71)申请人 中国水产科 学研究院黑龙江水产研 究所 地址 150000 黑龙江省哈尔滨市道里区松 发街43号 (72)发明人 王乐　霍堂斌　都雪　赵晨　宋聃　 王慧博　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 专利代理师 刘晓静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的 引物组及其 鉴别方法与应用 (57)摘要 本发明提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及 雷氏七鳃 鳗的引物组以及鉴定方法， 涉及基因检 测技术领域， 所述引物组包括引物F和引物R， 引 物F的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示， 引物R的核 苷酸序列如SEQIDNO.2所示； 鉴别方法包括以下 步骤： 1)提取待测鱼基因组DNA； 2)以提取的待测 鱼基因组DNA为模板， 以引物F和引物R对所述模 板进行PCR扩增获得扩增产物； 3)取所述扩增产 物进行凝胶电泳检测， 若有且仅有一条142bp的 扩增片段， 则待测鱼为雷氏七鳃鳗， 若有且仅有 一条250bp的扩增片段， 则待测鱼为东北七鳃鳗； 对东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗进行基因水平上鉴 别， 避免了外观形态难以区分、 背景来源不明确 的问题。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114854874 A 2022.08.05 CN 114854874 A 1.一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括引 物F和引物R， 引物F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 引物R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2 所示。 2.一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述 的引物组和检测试剂。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述引物组中引物F和引物R的使用浓度 分别为8～12 μmo l/L。 4.根据权利要求2或3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂包括10 ×PCR Buffer、 dNTP、 Ex Taq酶和d dH2O。 5.利用权利要求1所述的引物 组或权利要求2～4任意一项所述试剂 盒进行东北七鳃鳗 及雷氏七鳃鳗的鉴别方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)提取待测鱼基因 组DNA； 2)以提取的待测鱼基因组DNA为模板， 以引物F和引物R对所述模板进行PCR扩增获得扩 增产物； 3)取所述扩增产物进行凝胶电泳检测， 若有且仅有一条142bp的扩增 片段， 则待测鱼为 雷氏七鳃鳗， 若 有且仅有一条25 0bp的扩增片段， 则待测鱼为 东北七鳃鳗。 6.如权利要求5所述的东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗鉴别方法， 其特征在于， 所述步骤1)中 待测鱼基因提取于鳍条组织。 7.如权利要求5所述的用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗鉴别方法， 其特征在于， 所述 步骤2)PCR扩增的反应 体系以10 μL计， 包括以下组分： 30ng/ μL基因 组DNA 1.0 μL 10 μmol/L上游引物F  0.4 μL 10 μmol/L下游引物R  0.4 μL 10×PCR Buffer 1.5 μL 2mmol/L dNTP 1 μL 5U/ μL Ex Taq酶 0.2 μL ddH2O 5.5 μL； 所述步骤2)PCR扩增的扩增程序为： 94℃预变性2 min； 94℃ 变性30s， 60℃退火30s， 72℃ 延伸1min， 共35个循环； 72℃延伸5mi n； 4℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854874 A 2一种用于鉴别东北七鳃 鳗及雷氏七鳃 鳗的引物组及其鉴别方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测技术领域， 尤其涉及 一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗 的引物组及其 鉴别方法与应用。 背景技术 [0002]东北七鳃鳗(Lampetra  moriiBerg)及雷氏七鳃鳗(Lethenteron  reissneri)  均 隶属于七鳃鳗目七鳃鳗科七鳃鳗属， 为古老的无颌脊椎动物， 有重要的科研价值。 现有的东 北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的鉴定方法主要是依据外观形态区分或利用线粒体测序技术分析 DNA的部分序列。 前一种基于形态学鉴定的方法简单直观， 如检测体长、 体高、 头长、 吻长、 眼 间距、 尾柄长、 尾柄高与体长比等可量性状， 已有研究认为东北七鳃鳗体型居中， 而雷氏七 鳃鳗体型较小， 但两者间的差异较小， 尤其用于不同水体， 不同生长时期的种群鉴定时误差 较大。 此外， 早期研究认为雷氏七鳃 鳗两背鳍相连而东北七鳃鳗两背鳍分离， 这种形态差异 也已经被证实是 由产卵前后的体态变形引起， 以此作为分类依据也误差较大。 近些年 随着 分子生物学的兴起， 诞 生了后一种线 粒体DNA的检测方式， 这种方法基于C OI序列扩增分析， 通过与线 粒体组、 基因组等测序数据比对， 检测结果较为准确， 已广泛应用于水产领域的种 质资源鉴定及群体遗传多样性分析。 但测序分析所需样本材料较多， 实验过程较长， 成本也 较高， 且对检验人员的专业知识要求较高。 东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗作为中国国家二级重 点保护野生动物， 如何能在做好种群保护的前提下， 准确高效的做到个体或群体鉴定， 到目 前为止， 现有的技 术还没有解决这 一问题的方法。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组及其鉴 别方法， 在最大限度做好种群保护的前提下， 对东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗在基因水平上进 行鉴别， 有效的避免了 外观形态难以区分、 背景来源不明确等难以鉴定区分的问题。 [0005]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： [0006]本发明提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的引物组， 所述引物组包括 引物F和引物R， 引物F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 引物  R的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 [0007]本发明还提供了一种用于鉴别东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的试剂盒， 包括所述的引 物组和检测试剂。 [0008]优选的， 所述引物组中引物F和引物R的使用浓度为8～12 μmo l/L。 [0009]优选的， 所述检测试剂包括10 ×PCR Buffer、 dNTP、 Ex  Taq酶和d dH2O。 [0010]本发明还提供了利用所述的引物组、 所述试剂盒进行东北七鳃鳗及雷氏七鳃鳗的 鉴别方法， 包括以下步骤： [0011]1)提取待测鱼基因 组DNA；说　明　书 1/5 页 3 CN 114854874 A 3