(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210436132.3 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 江西省农业科 学院水稻研究所 地址 330200 江西省南昌市青云谱区南 莲 路602号 (72)发明人 杨宙　黄仁良　沈显华　韩瑞才　 朱珊　汤国平　 (74)专利代理 机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 1 1246 专利代理师 刘妮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/02(2006.01)A01H 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种培育菌根高效共生籼型 水稻的方法 (57)摘要 本发明公开一种培育菌根高效共生籼型水 稻的方法， 包括步骤一、 设计分子标记， 步骤二、 设计引物并利用引物进行PCR扩增， 步骤三、 电泳 检测并读取OsCERK 1的基因型， 步骤四、 亲本与籼 稻的杂交、 回交和自交并筛选OsCERK1DY基因纯 合的稳定株系； 本发明提供的分子标记可以用于 将OsCERK1DY基因向大部分籼稻品种的杂交转 育， 拓宽了OsCERK1DY基因应用范围， 同时提供的 分子标记为共显性， 能够在低世代筛选出 OsCERK1DY基因纯合单株， 加快育种进程， 本发明 方法操作简便， 实验无需特殊的试剂和耗材， 单 个样品的检测成本很低， 有利于开展大规模 标记 辅助选择育种。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114752701 A 2022.07.15 CN 114752701 A 1.一种培 育菌根高效共生籼型 水稻的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤一、 针对 控制菌根共生效率基因O sCERK1启动子区域的序列特 征设计分子标记； 步骤二、 设计引物GPC5 ‑F和引物GPC5 ‑R， 并利用该组引物对样品目标片段进行PCR扩 增， 获得样品的扩增产物； 步骤三、 使用3％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测， 并根据产物片段长度读取 OsCERK1的基因型； 步骤四、 将OsCERK1DY基因供体亲本与籼稻分别进行杂交、 回交和自交， 利用标记对各世 代单株进行检测， 筛 选出OsCERK1DY基因纯合的稳定株系。 2.根据权利要求1所述的一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 其特征在于： 所述步 骤一中的分子标记 位于水稻第 8号染色体上OsCERK1基因启动子区域内， 所述步骤四中的籼 稻在OsCERK1基因上游6 52bp位置插 入一段47bp的序列。 3.根据权利要求1所述的一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 其特征在于： 所述步 骤二中所用引物GPC5 ‑F核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 位于OsCERK1DY基因上游第718bp ‑ 699bp位置， 引物 GPC5‑R核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 位于OsCERK1DY基因上游第469bp ‑ 489bp位置 。 4.根据权利要求1所述的一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 其特征在于： 所述步 骤四中OsCERK1DY基因的纯合样品扩增产物为250bp条带， 籼稻型样品为297bp 条带， 获得的 杂合型样品同时出现25 0bp和297bp条带。 5.根据权利要求1所述的一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 其特征在于： 所述步 骤三中电泳检测操作具体为， 先以0.5 ×TBE作为电泳缓冲液， 取100ml加入至3g的琼脂糖 中， 煮沸使琼脂糖完全融化， 凝胶自然冷却3 min后倒入制胶槽中并插入梳齿， 待凝胶完全冷 却形成3％琼脂糖凝胶后拔出梳齿； 每个扩增样 品取10 μl点样电泳， 电泳电压为150V， 时长 为1h； 电泳 完成后用UVP凝胶成像系统即可观察结果。 6.根据权利要求1所述的一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 其特征在于： 所述步 骤四中杂交、 回交和自交具体包括 S1、 以含有OsCERK1DY基因的水稻单片段代换系CSSL ‑DY为供体亲本， 与作为受体亲本的 籼稻材料杂交， 获得16个F1代单株， 并进行杂合型分子标记检测； S2、 以杂交F1代为父本与籼稻材料回交， 对BC1F1代单株进行分子标记检测， 获得含有 OsCERK1DY基因的杂合型 单株； S3、 以杂合型BC1F1单株为父本与籼稻材料再次回交， 对BC2F1代单株进行分子 标记检测， 获得13个BC2F1杂合型单株； S4、 用13个BC2F1杂合型单株自交收种， 然后种植BC2F2群体， 并用分子 标记从每个群体中 筛选出3个O sCERK1DY基因纯合的单株； S5、 用筛选出的OsCERK1DY基因纯合的单株进行自交， 收种后种植BC2F3纯合株系； S6、 对BC2F3株系的农艺 性状进行考 察， 获得表现稳定的菌根高效共生籼稻品系。 7.根据权利要求6所述的一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 其特征在于： 所述S1 中杂合型单株分子标记检测结果全部为杂合 型， 所述S 2中分子标记检测结果含有OsCERK1DY 基因的杂合型单株有8个， 所述S6中最终获得了5份表现稳定的菌根高效共生籼稻品系， 所 述S1‑S4中的分子标记检测均使用引物GPC 5‑F和引物GPC 5‑R进行扩增。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752701 A 2一种培育菌根高 效共生籼型水稻的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及作物分子遗传育种技术领域， 尤其涉及一种培育菌根高效共生籼型水 稻的方法。 背景技术 [0002]丛枝菌根真菌又称AM真菌， 是一类分布最广泛的土壤真菌， 能够与80％的陆生植 物共生形成丛枝菌根， 在这个共生系统中， AM真菌从植物体获取脂类等有机物用于自身的 生长代谢， 同时协助植物从土壤中 吸收水分和矿物质， 这种菌根的形成可以扩大根系面积， 增加植物对土壤养分的吸收能力， 并提高养分利用效率， AM真菌与植物之间的共生过程包 括相互识别、 物理接触和菌根形成， 涉及到复杂的分子机制， 植物中相关基因的变异可能会 提高其与AM真菌的共生效率。 [0003]OsCERK1DY基因是从东乡野生稻中成功克隆的调控水稻与AM真菌共生效率的关键 基因， 携带该基因的水稻能与AM真菌高效共生， 如参考文献[Huang  R L,Li Z,Mao C,et  al.Natural  variation  at OsCERK1re gulates arbuscular  mycorrhizal  symbiosis  in  rice.New  Phytologist,2020,225(4):1762 ‑1776]， 该研究结果被专文点评为开辟了水稻 与AM真菌共生研究与育种利用的新领域， 具有极大的实际应用价值[Benoit  L.An  opportunity  to breed rice for improve  benefits  from the arbuscular   mycorrhizal symbiosis.NewPhyto logist,2020,2 25(4):1404 ‑1406]。 [0004]而目前的籼稻OsCERK1基因产生 的菌根共生效应较弱， 在水稻单倍型分析项目和 水稻变异图的4660份栽培稻品种中， 没有任何一个品种含有与OsCERK1DY完全相同的单倍体 型， 导致在此方面缺乏高效育种方法， 因此， 本发明提出一种培育菌根高效共生籼型水稻的 方法以解决现有技 术中存在的问题。 发明内容 [0005]针对上述问题， 本发明的目的在于提出一种培育菌根高效共生籼型水稻的方法， 该培育菌根高效共生籼型水稻的方法操作简便， 实验无需特殊的试剂和 耗材， 单个样品的 检测成本 很低， 有利于开展大规模标记辅助选择育种。 [0006]为实现本发明的目的， 本发明通过以下技术方案实现： 一种培育菌根高效共生籼 型水稻的方法， 包括以下步骤： [0007]步骤一、 针对控制菌根共生效率基因OsCERK1启动子区域 的序列特征设计分子标 记； [0008]步骤二、 设计引物GPC5 ‑F和引物GPC5 ‑R， 并利用该组引物对样品目标片段进行PCR 扩增， 获得样品的扩增产物； [0009]步骤三、 使用3％的琼脂糖凝胶对扩增 产物进行电泳检测， 并根据产物片段长度读 取OsCERK1的基因型； [0010]步骤四、 将OsCERK1DY基因供体 亲本与籼稻分别进行杂交、 回交和自交， 利用标记对说　明　书 1/4 页 3 CN 114752701 A 3