(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210440146.2 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 首都医科 大学附属北京朝阳医院 地址 100020 北京市朝阳区工 体南路8号首 都医科大学附属北京朝阳医院 (72)发明人 隗明　王帅　王鹏　刘骏　谷丽　 (74)专利代理 机构 北京八月瓜知识产权代理有 限公司 1 1543 专利代理师 袁丹丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种检测结核分枝杆菌复合群16SrRNA 基因 的引物、 探 针、 方法和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测结核分枝杆菌复合 群16SrRNA基因的引物、 探针、 方法和试剂盒， 涉 及生物技术领域； 第一个方面， 本发明提供了一 种检测结核分枝杆菌复合群16SrRNA 基因的引物 和探针， 包 括： 上游引物 MTB‑F primer， 其核苷酸 序列为： ATGCCGCGAGGTTAAGCG； 下游引物MTB ‑R  p r i m e r ，其 核 苷 酸 序 列 为 ： TGATCTGCGATTACTAGCGACT； 本发明仅有2个探针， 相较于Xpert  MTB/RIF产品而言显著降低了成 本， 并且保证了与Xpert  MTB/RIF相当的灵敏度 和特异性， 因此该产品作为结核核酸检测初筛试 剂盒， 对减 轻个人和国家医保支出将会起到较大 作用。 权利要求书2页 说明书9页 CN 114990239 A 2022.09.02 CN 114990239 A 1.一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的引物和探针， 其特 征在于： 包括： 上游引物MTB ‑F primer， 其核苷酸序列为： ATGC CGCGAGGTTAAGCG； 下游引物MTB ‑R primer， 其核苷酸序列为： TGATCTGCGAT TACTAGCGACT； 结核菌检测探针MTB ‑Taqman probe， 其核苷酸序列为： C CTTAAAAGCCGG； 上游引物Gl obin‑F primer， 其核苷酸序列为： GA AGAGCCAAGGACAGGTAC； 下游引物Gl obin‑R primer， 其核苷酸序列为： CA ACTTCATCCACGTTCACC； 内参探针Gl obin‑Taqman probe， 其核苷酸序列为： CTGTCATCACT TAGACCTC。 2.根据权利要求1所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的引物和探针， 其特征在于： 所述结核菌检测探针MTB ‑Taqman probe的序列5 ’端标记的荧光基团为FAM， 所 述结核菌检测探针MTB ‑Taqman probe的序列3 ’端标记的淬灭基团为MGB。 3.根据权利要求1所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的引物和探针， 其特征在于： 所述内参探针Globin ‑Taqman probe的序列5 ’端标记的荧光基团为ROX， 所述 内参探针Gl obin‑Taqman probe的序列3 ’端标记的淬灭基团为MGB。 4.一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的试剂盒， 其特征在于： 至少包括如权 利要求1‑3中任一所述的引物和探针， 以及阳性质控品。 5.根据权利要求4所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的试剂盒， 其特 征在于： 所述阳性质控品的序列 为： ATGCCGCGAGGTTAAGCGAATCCTTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGA TCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTA ATCGCAGATCA。 6.一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 步骤一： 制备由氢 氧化钠、 蒸馏水与异丙醇所组成的处 理试剂； 步骤二： 将下呼吸道标本加入处 理试剂， 用振荡器震荡后静置， 以进行充分消化； 步骤三： 取2mL充分消化的呼吸道样本与EP管中， 离心后静置； 步骤四： 去除静置后EP管内的上清液， 取200μL处理试剂重悬沉淀， 随后加入至核酸提 取试剂盒中； 步骤五： 将核酸 提取试剂盒放入 全自动快速核酸 提取仪进行核酸 提取； 步骤六： 待提取 结束后， 将核酸产物用移液器吸出至1.5mL  EP管中， 于4℃下储 存备用； 步骤七： 配制PCR反应液， 并分装至PCR八连 管， 每管23 μL； 步骤八： 将2μL核酸产物加入至步骤七的PCR反应液中， 在核酸扩增仪上进行核酸扩增 反应； 步骤九： 待PCR反应完成后， 进行 结果判读， 判读依据为： MTB‑Taqman probe Globin‑Taqman probe 结果 阴性 阳性 结核菌检测阴性 阳性 阳性/阴性 结核菌检测阳性 阴性 阴性 不确定 其中， 阴性： 样本无CT值和S形曲线； 阳性： 样本有CT值和S形曲线； 不确定： PCR反应抑制， 对提取核酸产物进行5倍稀释后重新进行 试验。 7.根据权利要求6所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的方法： 其特征 在于： 步骤二中， 下呼吸道标本为痰或支气管肺泡灌洗液。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990239 A 28.根据权利要求6所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的方法： 其特征 在于： 步骤二中， 震荡时间10 ‑20s， 静置10 ‑20min。 9.根据权利要求6所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的方法： 其特征 在于： 步骤 七中， PCR反应液的配方为： 其中， MTB ‑F primer、 MTB ‑R primer、 MTB ‑Taqman probe、 Globin ‑F primer、 Globin ‑R  primer、 Gl obin‑Taqman probe取自如权利要求1 ‑3中任一所述的引物和探针。 10.根据权利 要求6所述的一种检测结核分枝杆菌复合群16S  rRNA基因的方法： 其特征 在于： 步骤八中， 核酸扩增反应的条件为： 95℃ ×3min， 循环1次； 95℃ ×15s， 60℃ ×1min， 循 环40次。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990239 A 3