(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210436869.5 (22)申请日 2022.04.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114539362 A (43)申请公布日 2022.05.27 (73)专利权人 中国疾病预防控制中心传染病预 防控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 肖迪　李天一　王磊　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 商秀玲 (51)Int.Cl. C07K 14/00(2006.01) C12N 15/11(2006.01)G01N 27/64(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (56)对比文件 US 2006024763 A1,2006.02.02 US 2003077685 A1,20 03.04.24 审查员 陈中伟 (54)发明名称 一种肉毒毒素特异 性底物肽、 检测试剂盒和 检测方法 (57)摘要 本发明涉及分析检测技术领域， 具体涉及一 种肉毒毒素特异性底物肽、 检测试剂盒和检测方 法。 本发明提供肉毒毒素特异性底物肽， 所述底 物肽为氨基酸序列如SEQ  ID NO.1‑4所示的多肽 中的一种或多种。 利用该特异性底物肽结合其经 肉毒毒素切割产生的血清型特异性目的肽段， 能 够实现较为特异、 灵敏、 准确的肉毒毒素及其血 清型鉴定。 本发 明还提供了基于该特异性底物肽 的检测试剂盒以及检测方法， 利用该试剂盒和方 法能够快速、 高通量、 灵敏、 准确地进行肉毒毒素 及其血清型鉴定， 为肉毒毒素检测提供技术支 撑。 权利要求书3页 说明书8页 序列表3页 附图4页 CN 114539362 B 2022.07.26 CN 114539362 B 1.A型肉毒毒素特异性底物肽， 其特征在于， 所述底物肽为氨基酸序列如SEQ  ID NO.1 所示的多肽， 其中， SEQ  ID NO.1所示序列中， Xa a代表正亮氨酸。 2.生物材 料， 其特征在于， 所述 生物材料为以下 （1） ‑（4） 中的任一种： （1） 核酸分子， 所述核酸分子编码权利要求1所述的A型肉毒 毒素特异性底 物肽； （2） 表达盒， 所述表达盒包 含 （1） 中所述的核酸分子； （3） 载体， 所述载体包 含 （1） 中所述的核酸分子； （4） 宿主细胞， 所述宿主细胞包含 （1） 中所述的核酸分子， 或包含 （2） 中所述的表达盒， 或包含 （3） 中所述的载体。 3.一种检测 A型肉毒毒素的特征性多肽组， 其特征在于， 所述特征性多肽组由氨基酸序 列如SEQ ID NO.5‑6所示的多肽组成， 其中， SEQ  ID NO.6所示序列中， Xa a代表正亮氨酸。 4.权利要求1所述的A型肉毒毒素特异性底物肽或权利要求2所述的生物材料或权利要 求3所述的检测A型肉毒 毒素的特 征性多肽组的以下 （1） ‑（2） 中的任一种应用： （1） 在制备用于检测A型肉毒 毒素的产品中的应用； （2） 在非疾病诊断目的 的A型肉毒 毒素检测中的应用。 5.一种A型肉毒 毒素检测试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包 含以下 （1） 和 （2） ： （1） 权利要求1所述的A型肉毒 毒素特异性底 物肽； （2） 权利要求3所述的检测A型肉毒 毒素的特 征性多肽组。 6.根据权利要求5所述的肉毒毒素检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包含样本富 集试剂和/或反应缓冲液； 所述样本富 集试剂包 含链霉亲和素 ‑生物素磁珠偶联抗体； 所述反应缓冲液包 含0.05‑0.1M Hepes、 20 ‑30mM DTT和15‑25 μM ZnCl2。 7.根据权利要求5或6所述的肉毒毒素检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含选 自PBST、 BSA、 α ‑氢基‑4‑羟基肉桂酸、 质谱仪标准校正液中的一种或多种。 8.一种非疾病诊断目的 的A型肉毒 毒素检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 采用待测样品对权利要求1所述的肉毒毒素特异性底物肽进行酶切 处理， 得到酶切产 物； 将所述酶切产物进行质谱分析， 根据酶切产物 的氨基酸序列或质谱峰的质荷比m/z判 断待测样品是否含有A型肉毒 毒素。 9.根据权利要求8所述的非疾病诊断目的的A型肉毒毒素检测方法， 其特征在于， 若酶 切产物中含有氨基酸序列如SEQ  ID NO.5‑6所示的多肽， 或者质谱峰中含有质荷比m/z为 1427±1和999±1的特征峰， 则待测样品中含有A型肉毒 毒素。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 将待测样品与PBST溶 液混合， 得到第一混合液； 将所述第一混合液与样本富 集试剂混合， 得到第二混合液； 将所述第二混合液于15 ‑30℃孵育30min‑2h后， 收集磁珠沉淀得到第一磁珠沉淀； 将所述第一磁珠沉淀与BSA混合， 于25 ‑40℃孵育后， 收集磁珠沉淀得到第二磁珠沉淀； 将所述第二磁珠沉淀与反应缓冲液和权利要求1所述的A型肉毒毒素特异性底物肽混 合， 于30‑40℃反应3 0min‑4h； 反应结束后， 收集反应上清液进行质谱分析；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114539362 B 2其中， 所述样本富 集试剂包 含链霉亲和素 ‑生物素磁珠偶联抗体； 所述反应缓冲液包 含0.05‑0.1M Hepes、 20 ‑30mM DTT和15‑25 μM ZnCl2。 11.A、 B、 E和F型肉毒毒素特异性底物肽组， 其特征在于， 所述底物肽组由氨基酸序列如 SEQ ID NO.1‑4所示的多肽组成， 其中， SEQ  ID NO.1所示序列中， Xaa代表正亮氨酸， SEQ  ID  NO.3所示序列中Xa a代表高精氨酸。 12.生物材 料， 其特征在于， 所述 生物材料为以下 （1） ‑（4） 中的任一种： （1） 核酸分子， 所述核酸分子编码权利要求11所述的A、 B、 E和F型肉毒毒素特异性底物 肽组； （2） 表达盒， 所述表达盒包 含 （1） 中所述的核酸分子； （3） 载体， 所述载体包 含 （1） 中所述的核酸分子； （4） 宿主细胞， 所述宿主细胞包含 （1） 中所述的核酸分子， 或包含 （2） 中所述的表达盒， 或包含 （3） 中所述的载体。 13.一种检测A、 B、 E和F型肉毒毒素的特征性多肽组， 其特征在于， 所述特征性多肽组由 氨基酸序列如SEQ  ID NO.5‑12所示的多肽组成， 其中， SEQ  ID NO.6所示序列中， Xaa代表正 亮氨酸， SEQ  ID NO.9所示序列中Xa a代表高精氨酸。 14.权利要求11所述的A、 B、 E和F型肉毒毒素特异性底物肽组或权利要求12所述的生物 材料或权利要求13所述的检测A、 B、 E和F型肉毒毒素的特征性多肽组的以下 （1） ‑（3） 中的任 一种应用： （1） 在制备用于检测A、 B、 E和F 型肉毒毒素的产品中的应用； （2） 在制备用于甄别A、 B、 E和F 型肉毒毒素的产品中的应用； （3） 在非疾病诊断目的 的A、 B、 E和F 型肉毒毒素检测中的应用。 15.一种肉毒 毒素检测试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包 含以下 （1） 和 （2） ： （1） 权利要求1 1所述的A、 B、 E和F 型肉毒毒素特异性底 物肽组； （2） 权利要求13所述的检测A、 B、 E和F 型肉毒毒素的特 征性多肽组。 16.根据权利要求15所述的肉毒毒素检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包含样本 富集试剂和/或反应缓冲液； 所述样本富 集试剂包 含链霉亲和素 ‑生物素磁珠偶联抗体； 所述反应缓冲液包 含0.05‑0.1M Hepes、 20 ‑30mM DTT和15‑25 μM ZnCl2。 17.根据权利要求15或16所述的肉毒毒素检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包含 选自PBST、 BSA、 α ‑氢基‑4‑羟基肉桂酸、 质谱仪标准校正液中的一种或多种。 18.一种非疾病诊断目的的A、 B、 E和F型肉毒毒素检测方法， 其特征在于， 所述方法包 括： 采用待测样品对权利要求11所述的A、 B、 E和F型肉毒毒素特异性底物肽组进行酶切处 理， 得到酶切产物； 将所述酶切产物进行质谱分析， 根据酶切产物 的氨基酸序列或质谱峰的质荷比m/z获 得以下结果中的至少一种： （1） 待测样品是否含有肉毒 毒素； （2） 待测样品含有的肉毒 毒素的血清型。 19.根据权利要求18所述的非疾病诊断目的的A、 B、 E和F型肉毒毒素检测方法， 其特征权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114539362 B 3