(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210440583.4 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 湖北大学 地址 430062 湖北省武汉市武昌区友谊大 道368号 (72)发明人 董衍明　马立新　王媛　罗婷　 邱李炀　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本发明属于B19病毒检测技术领域， 公开了 一种PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测试剂盒 及检测方法， 检测试剂盒包括三条或单条引导 PfAgo靶向B19病毒ns1基因的gDNA， 其序列SEQ   ID NO:1～3所示； gDNA引导PfAgo特异性切割B19 病毒ns1基因片段， 进而生成靶向荧光分子信标 的gn‑DNA进行第二轮切割， 实现对B19病毒特异 性和灵敏性检测。 相对于现有的B19病毒检测方 法， 本发明不仅检测成本低， 灵敏度高且特异性 强， 具有重要的实际应用价 值。 权利要求书1页 说明书11页 序列表4页 附图5页 CN 114703328 A 2022.07.05 CN 114703328 A 1.一种检测试剂盒， 其特 征在于， 包括： 引导PfAgo蛋白靶向B19病毒ns1基因的gDNA， 具体为如序列SEQ  ID NO:1所示的gt ‑ B19、 如序列 SEQ ID NO:2所示的gf ‑B19以及如序列SEQ  ID NO:3所示的gr ‑B19， 或仅为如序 列SEQ ID NO:2所示的gf ‑B19； 带有荧光基团和猝灭基团的分子信标； PfAgo蛋白。 2.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述分子信标的序列如SEQ  ID NO: 4所示。 3.根据权利要求1所述的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒还包括用于特异性 扩增ns1基因上靶标序列的扩增试剂。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述扩增试剂包括序列如SEQ  ID  NO:5～6所示的引物对。 5.如权利要求1～4任意一项权利要求所述的检测试剂盒在非疾病诊断和治疗目的中 鉴定或辅助鉴定B19病毒的应用。 6.一种PfAgo蛋白介导的B19病毒 核酸检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 对待测样本扩增得到tDNA； S2、 设立包括5 ’磷酸化的gDNA、 PfAgo蛋白、 tDNA、 PfAgo反应缓冲液和分子信标的反应 体系， 进行切割反应； S3、 反应结束后， 对上述反应 体系进行荧 光检测。 7.根据权利要求6所述PfAgo 蛋白介导的B19病毒核酸检测方法， 其特征在于， 步骤S2所 述反应体系中， gDNA与PfAgo蛋白的摩尔比为1∶ 46 0。 8.根据权利 要求6所述PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测方法， 其特征在于， 所述切割 反应的温度为90～ 98℃。 9.根据权利 要求8所述PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测方法， 其特征在于， 所述切割 反应的温度为95℃。 10.根据权利要求6所述PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测方法， 其特征在于， 步骤S2 所述反应 体系中， tDNA的含量≥0.1pmo l。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703328 A 2PfAgo蛋白介导 的B19病毒核酸检测试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于B19病毒检测技术领域， 具体涉及一种PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸 检测试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]B19病毒属细小病毒科红细胞病毒属， 是目前为止能够感染并引起人类疾病的仅 有的两种细 小病毒之一。 作为一种重要病原， B19病毒感染不同人群能够引起如儿童传染性 红斑、 急性再障危象、 胎儿水肿甚至死胎等疾病， 同时， 由于其可经输血和血液制 品传播， B19病毒还与输血安全及血液制品的病毒安全性密切相关， 因此， 开 发新的病毒检测技术具 有重要应用价 值。 [0003]目前， B19病毒核酸检测主要包括斑点杂交法、 原位杂交法、 聚合酶链反应法。 近年 来， 随着以CRISPR/Cas9为代表的新型基因编辑技术的出现并广泛应用于病原微生物等的 检测， 使得传统分子诊断技术迈入了低 成本、 高灵敏性、 高特异性的新型分子诊断阶段。 作 为DNA病毒， B19病毒的新型检测系统E ‑CRIPSR法也已成功建立， 主要是基于CRISPR ‑Cas12a 特异性切割DNA性质， 其检测灵敏度达到pmol级别， 这表明基于新型基因编辑酶CRISPR/Cas 系统的分子诊断方法在B19病毒检测过程中具有潜在的应用前景。 但是， 鉴于CRISPR/Cas系 统中gRNA的合成费用昂贵问题， 开发新的分子诊断方法具有重要意 义。 [0004]Argonaute蛋白是核酸引导的核酸内切酶， 在真核生物中， 该蛋白参与了RNA沉默 或RNA向导的RNA切割； 而在原核生物中， 该蛋白可在短的DNA序列的引导下切割ssDNA或 ssRNA， 其中NgAgo曾经被认为是替代Cas9的新型基因编辑 酶。 目前， 尽管基于Agos的基因编 辑方法并未建立成功， 但是其在体外 分子诊断方面的应用仍 获得了重要进展。 PfAgo是一种 从嗜热古生火球菌(Pyrococcus  furiosus)提取出的Argonaute蛋白， 可在 短的DNA序列的 引导下切割ssDNA或ssRNA。 同时， PfAgo切割产生的短单链DNA可与apo ‑PfAgo蛋白结合， 在 同一反应体系中启动下游靶标的第二轮切割， 基于该原理发明人已经建立的PfAgo介导的 核酸检测(PAND)技术， 可实现对人乳头瘤病毒(HPV)和SARS ‑CoV2的核酸检测(He  R,Wang  L,Wang F,Li W,Liu Y,Li A,Wang Y,Mao W,Zhai C,Ma L.Pyrococcus  furiosus   Argonaute ‑mediated  nucleic acid detection.Chem  Commun(Camb).2019,55( 88): 13219‑22； Wang F,Yang J,He R,Yu X,Chen S,Liu Y,Wang L,Li A,Liu L,Zhai C,Ma  L.PfAgo‑based detection of SARS‑CoV‑2.Biosens Bioelectron.2021,17 7:112932)。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本 发明的目的在 于利用PfAgo介导的核酸检测技术实现对B19病毒的检 测， 并建立 一套高灵敏度和特异性的B19病毒的核酸检测系统。 [0006]为了实现上述目的， 本发明的技 术方案具体如下： [0007]一种检测试剂盒， 包括： [0008]引导PfAgo蛋白靶向B19病毒ns1基因的gDNA， 具体为如序列SEQ  ID NO:1所示的说　明　书 1/11 页 3 CN 114703328 A 3