(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210437931.2 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 上海睿璟生物科技有限公司 地址 201112 上海市闵行区召楼路3 632号2 幢5层 (72)发明人 杨峰　龚伟　李雯　洪跟东　 (74)专利代理 机构 北京汇众通达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11622 专利代理师 尹全杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测RET基因M918 T突变的PCR试剂盒及 其检测方法 (57)摘要 本发明涉及基因突变检测领域， 公开了一种 检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒， 包括核酸 扩增试剂和对照品。 所述核酸扩增试剂包括RET   M918T反应液， 所述 反应液中含有用于检测RET基 因M918T突变的特异性引物和荧光探针。 所述核 酸扩增试剂还包括ddPCR  Mix。 本发明还公开了 上述检测RET基因M918T 突变的PCR试剂盒的检测 方法的检测方法。 本申请的试剂盒采用数字PCR 技术， 可对甲状腺结节细针穿刺活检样本中的 RET基因M918 T突变进行定量检测， 从而辅助诊断 甲状腺结节的良恶性。 权利要求书2页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 115029436 A 2022.09.09 CN 115029436 A 1.一种检测RET基因M9 18T突变的PCR试剂盒， 其特征在于， 所述反应液中含有用于检测 RET基因M918T突变的特异性引物、 野生型荧光探针和突变型荧光探针。 所述特异性引物包 括一对上游引物和下游引物。 所述荧光探针5 ’端添加荧光报告基团， 3 ’端添加荧光猝灭基 团。 优选地， 所述荧光探针为MGB探针。 优选地， 所述突变型型荧光探针5 ’端添加FAM基团， 3 ’ 端添加MGB基团； 所述野生型荧光探针5 ’端添加VIC基团， 3 ’端添加MGB基团。 优选地， 所述特 异性引物和荧 光探针的序列 与修饰如下： 上游引物5 ’ ‑CTCTTTAGGGTCGGATTCCAGTT‑3’ 下游引物5 ’ ‑TGCGTGGTGTAGATATGATCA AAA‑3’ 野生型探针5 ’ ‑FAM‑ATGGATGGCAATTG‑MGB‑3’ 突变型探针5 ’ ‑VIC‑AATGGACGGCAATTG‑MGB‑3’； 所述核酸扩增试剂还 包括2×Droplet PCR Supermix。 2.根据权利要求1所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒， 其特征在于， 所述反应 液中包含的特异性引物含量 为900nmol/L， 荧光探针含量 为250nmol/L。 3.根据权利要求1所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒， 其特征在于， 所述 ddPCRMix包括反应所需的dNTPs和缓冲液。 优选地， 所述ddPCR  Mix为Droplet  PCR  Supermix。 更优选地， Droplet  PCR Supermix为2 ×工作液， 配制时加入量为总体系量的一 半。 4.根据权利要求1 ‑3任一所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒， 其特征在于， 所 述对照品还 包括阳性对照和阴性对照。 5.根据权利要求4所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒， 其特征在于， 所述阴性 对照为工艺用水， 所述阳性对照为 突变质粒和野生型质粒混合物。 6.根据权利要求5所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒， 其特征在于， 所述突变 型质粒所包含的RET基因片段序列如SEQ  ID NO.1所示。 所述野生型质粒所包含的RET基因 片段序列如SEQ  ID NO.2所示。 7.基于如权利 要求1‑6任一所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒的检测方法， 其 特征在于， 包 含步骤如下： (1)根据不同样本类型选择相应商业DNA提取 试剂盒进行DNA的提取， 作为检测的模板； (2)配制RET  M918T检测数字PCR反应液， 其包 含： (3)在微滴生成芯片上， 按先后顺序加微滴生成油70 μL， 数字PCR反应液20 μL。 微滴生成 芯片放入样本制备仪里生成微 滴。 生成后的微 滴转移到PCR扩增板上， 用封膜仪进行封膜。 (4)将PCR扩增板放置 到PCR仪上进行扩增， 扩增程序为：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029436 A 2(5)扩增完成， 将PCR板放置到微滴分析仪内进行数据读取。 获得数据后， 划定阈值分析 结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029436 A 3