(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210452062.0 (22)申请日 2022.04.26 (71)申请人 中国林业科 学研究院林业研究所 地址 100091 北京市海淀区香 山路东小 府1 号 (72)发明人 胡建军　张磊　周星鲁　王丽娟　 (74)专利代理 机构 北京市广友专利事务所有限 责任公司 1 1237 专利代理师 耿小强 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/20(2019.01) G16B 30/10(2019.01) (54)发明名称 一种与杨树木材基本密度相关的SNP标记及 应用 (57)摘要 本发明公开了一种与杨树木材基本密度相 关的SNP分子标记， 涉及杨树遗传育种领域； 该标 记位于毛果杨 基因组3.0版本参考序列16号染色 体上第1,394,234bp处。 本发明通过eQTL分析确 定其为影 响杨树木材基本密度的关键调控位点， 同时调控纤维素合酶和次生细胞壁相关转录因 子的表达。 本发 明的与杨树木材基本密度相关的 SNP分子标记为杨树木材基本密度选育提供了新 的选择， 在加速杨树育种进程上有重要应用价 值。 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 CN 115386650 A 2022.11.25 CN 115386650 A 1.一种与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记， 其位于毛果杨基因组3.0版本参考序 列16号染色体上第1,394,234bp处， 存在A/T 多态性。 2.根据权利 要求1所述与杨树木材基本密度相关的SNP 分子标记， 其特征在于： 所述SNP 分子标记的等 位基因为A和T。 3.根据权利 要求1所述与杨树木材基本密度相关的SNP 分子标记， 其特征在于： 所述SNP 分子标记的等 位基因对应的基因型为A A基因型和AT基因型。 4.与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记的获得 方法， 包括以下步骤： 步骤1， 提取杨树杂交群体发育木质部总RNA， 并反转录为cDNA用于构建测序文库进行 转录组测序； 步骤2， 测定表型性状； 步骤3， 进行基因分型； 步骤4， 进行 eQTL分析和热点分析， 筛 选关键位 点。 5.根据权利要求4所述与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记的获得方法， 其特征在 于： 步骤1具体如下： 使用RNAprep  Pure Plant Plus Kit试剂盒提取丹红杨 ×通辽1号杨杂交群体发与木 质部的总RNA， 每份样品中3 μg的RNA， 使用NEBNext  R UltraTMRNA  Library Prep Kit试剂 盒构建测序文库制备； 然后， 在Illumina  Hiseq平台上生成150bp的配对端读数； 过滤原始 序列， 并使用TopHat  v2.0.12绘制到参 考基因组。 6.根据权利要求5所述与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记的获得方法， 其特征在 于： 步骤2具体如下： 利用排水法测定 木材的基本密度。 7.根据权利要求5所述与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记的获得方法， 其特征在 于： 步骤3具体如下： 使用GATK4.0软件， 将杂交群体全基因组重测序数据和转录组数据比对到参考基因组 识别唯一位点的SNPs， 随后， 将 两个SNP数据集合并， 按照以下标准过滤： ①缺失率小于0.1； ②最小等位基因频率大于0.05； ③哈温平衡大于0.001； ④个体SNP完整度大于0.95； ⑤个体 平均深度大于等于4； 最终获得 1 504 840个SNP数据， 用于后续分析； 使用ANNOVAR对鉴定到 的SNP进行注释， 即内含子、 外 显子、 基因间区、 U TR区； 最终 获得1 504 840个SNP。 8.根据权利要求6所述与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记的获得方法， 其特征在 于： 步骤4具体如下： 使用HTSeq， 对各样本进行基因水平的定量分析， 并对测序深度以及基因长度进行校 正， 以FPKM表示基因的表达值， 利用Matr ix eQTL软件包中线性模型进行表达数量性状定位 分析， 计算每个样本的基因型和标准化后的基因表达量的关联性， 为降低SNPs与基因表达 之间的假阳性， 利用Bonferroni  correction确定阈值(P<1.7*10‑12)， 通过P值过滤获得与 基因表达量显著关联的SNP位点， 即eQTL结果， 从而确定基因突变与基因表达量之间的关 系， 根据显著关联的SNP的位置和与其产生效应的基因在基因组上的物理距离， 将eQTL分为 cis‑eQTL和trans ‑eQTL， 含eQT L位点的基因被称为eGene， 计算全基因组中相邻成对基因的 基因间隔距离， 发现95％相邻基因之间的距离≤25kb， 因此， SNP位于相应基因内或具转录 起始位点或基因的末端 小于25kb， 则被分类为cis ‑eQTL， 否则为t rans‑eQTL； 利用hot‑scan进行识别， 确定识别窗口为25kb； 调控基因数量最多为3226个， 其中包含权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115386650 A 2131个转录因子； 热点共包含51个SNP位点， 其中15个位于基因间隔区， 其余位于基因内； 16 号染色体上1  394 234bp的A变为T， 该位点调控基因数量最多， 调控该热点中的3210个基 因； 基因座主要分为AA(n＝191)和AT(n＝43)两种基因型； 对hotspot12654的调控基因进行 heatmap聚类分析， 结果表明： 3226个基因共划分为A、 B两类， 分别包含2719、 507个基因， 而 样本间的聚类也划分为两类， 与基因型划分基本一致； CesAs基因在AA/AT两种基因型间均 呈现显著差异表达， AA基因型表达量高； 木质素生物 合成的漆酶及参与SCW形成的PtrMYB3、 PtrMYB20、 PtrMYB156同样受到 hotspot126 54的调控， 但均在AT基因型中 高表达。 9.权利要求1所述与杨树木材基本密度相关的SNP分子标记在调控杨树木材基本密度 中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115386650 A 3