(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210446158.6 (22)申请日 2022.04.26 (71)申请人 湖南师范大学 地址 410081 湖南省长 沙市岳麓区麓山路 36号 (72)发明人 谢华平　孙鲁宁　杨博宇　覃彬　 刘玲　杨楠　李可依　 (74)专利代理 机构 北京盛询知识产权代理有限 公司 11901 专利代理师 袁善民 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/89(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (54)发明名称 一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马 鱼的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基因敲除选育adgrg1基 因缺失型斑马鱼的方法， 涉及基因敲除技术领 域。 本发明公开了一种敲除斑马鱼a dgrg1基因的 引物组该引物组包括如SEQIDNO： 1或SEQIDNO： 2 所示的上游引物和如SEQIDNO： 3所示的下游引 物。 该基因敲除选育a dgrg1基因缺失型斑马鱼的 方法包括： 以如SEQIDNO： 4所示的DNA序列为模 板， 利用该引物组进行PCR扩增， 再经体外转录得 到gRNA； 将Cas9mRNA和所述gRNA显微注射入斑马 鱼胚胎中， 再经杂交和自交， 即得该adgrg1基因 缺失型斑马鱼。 本发明通过CRISPR/Cas9基因编 辑技术， 选育出了adgrg1基因缺失型斑马鱼。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 115029352 A 2022.09.09 CN 115029352 A 1.一种敲除斑马鱼adgrg1基因的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括如SEQ  ID NO： 1 或SEQ ID NO： 2所示的上游引物和如SEQ  ID NO： 3所示的下游引物。 2.一种根据权利要求1所述的引物组选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： (1)以如SEQ  ID NO： 4所示 的DNA序列为模板， 利用权利要求1所述 的引物组进行PCR扩 增， 得到PCR产物； (2)所述PCR产物体外转录得到gRNA； (3)将Cas9  mRNA和所述gRNA显微注射入斑马鱼胚胎中， 再经培育和筛选得到adgrg1基 因缺失型斑马鱼F0代； (4)所述adgrg1基因缺失型斑马鱼F0代与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎， 再经培育 和筛选得到adgrg1基因缺失型斑马鱼F1代； (5)所述adgrg1基因缺失型斑马鱼F1代自交两代， 即得 所述adgrg1基因缺失型斑马鱼。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述PCR的反应体系为： 5 ×enhancer   Buffer 5 μL， 2X Master Mix 12.5 μL， 10 μM上游引物2.5 μL， 10 μM下游引物2.5 μL， 模板1μL， ddH2O 1.5 μL。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述PCR的反应程序为： 95℃3min； 95℃ 30s， 退火6 0℃15s， 延伸72℃15s， 3 0个循环； 再72℃3min。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 体外转录反应体系为： 模板 DNA 6.5 μL， 10 ×Buffer 2 μL， 50/100mM  DTT 2 μL， 40U/ μL  RNase抑制剂0.5 μL， 10mM  rATP 1 μL， 10mM rATP 1μL， 10mM  rUTP 1μL， 10mM  rCTP 1μL， 10mM  rGTP 1μL， T7 RNA聚合酶1μL， Nuclease ‑Free Water 1 μL。 6.根据权利要 求2所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 显微注射体系为MgCl210 mM， Cas9 mRNA 150ng/ μL， gRNA 20 ng/ μL， 无核酸酶H2O补足至4 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029352 A 2一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 基因敲除技术领域， 特别是涉及一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型 斑马鱼的方法。 背景技术 [0002]adgrg1基因位于斑马鱼第7号染色体上， 包含13个外显子和12个内含子， cDNA全长 1947bp， 编码 648氨基酸， adgrg1包含有7个跨膜结构域和一个 G蛋白偶联受体蛋白水解位点 结构域。 adgrg1被证明作用于神经胶质细胞发育的上游或之内， 并调节少突胶质细胞祖细 胞的增殖。 在多种器官中均有表达， 包括心脏， 肠道， 肝， 神经系统， 胸腹膜区和三叉神经基 板。 该基因的人类直系同源物 adgrg1(粘附G蛋白偶联受体G1)与双侧额顶多小脑回和双侧 外侧裂多 小脑回有关。 [0003]斑马鱼与人类发育过程中的基因、 信号通路有高度同源性， 且adgrg1基因进化上 较为保守， 研究发现adgr g1在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。 而且， 与其他动物模型相比， 斑马鱼具有个体小、 易于饲养、 发育快、 繁殖能力强、 体外受精、 胚胎体外发育且透明等优 点。 目前， 还尚未有关于基因敲除选 育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法报道。 [0004]基因打靶技术起源于20世纪80年代末， 是一种通过对基因组进行定点修饰来研究 基因功能的重要方法手段， 也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。 该技术主要是利用缺失 突变、 基因灭活、 染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息， 并且 在生殖系中稳定遗传后表达突变性状， 从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作 用， 所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。 传统的基因打靶技术是建立在胚 胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上， 故打靶技术效率极低。 2013年初， 一种全新的 人工核酸内切酶clustered  regularly  interspaced  short palindromic  repeats (CRISPR)/CRISPR ‑associated(Cas)9， 能更高效且更精确地在生物 体基因组中沉默特定基 因， 且制作简单、 成本低， 且可同时对靶基因上多个位点进行剪切， 沉默任意数目的单个基 因， 但同时该技 术存在一定的缺陷， 其脱靶率相对较高。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种基因敲除选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法， 以解决 上述现有技术存在的问题， 通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术， 在斑马鱼的adgrg1基因上设计 合适的打靶位 点， 通过CRIS PR/Cas9基因编辑 技术， 选育出adgrg1基因缺失型斑马鱼。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0007]本发明提供一种敲除斑马鱼adgrg1基因的引物组， 所述引物组包括如SEQ  ID NO： 1或SEQ ID NO： 2所示的上游引物和如SEQ  ID NO： 3所示的下游引物。 [0008]本发明还提供一种根据上述的引物组选育adgrg1基因缺失型斑马鱼的方法， 包括 以下步骤： [0009](1)以如SEQ  ID NO： 4所示的DNA序列为模板， 利用上述的引物组进行PCR扩增， 得说　明　书 1/7 页 3 CN 115029352 A 3