(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210448605.1 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 南方海洋科学与工程广东省实验室 （广州） 地址 511458 广东省广州市南沙区南沙街 资讯科技园海 滨路1119号 申请人 中国水产科 学研究院南海水产研究 所 (72)发明人 郭梁　张殿昌　张楠　朱克诚　 郭华阳　刘宝锁　赵方草　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于棘头梅童鱼SSR多重 PCR引物， 所述SSR多重PCR引物包括9对特异性引 物， 分别为引物对Clu982、 Clu1605、 Clu740、 Clu493、 Clu1563、 Clu873、 Clu1288、 Clu1020和 Clu370， 其中每对引物包 括一个正向引物和一个 反向引物， 所述9对特异性引物的碱基序列依序 分别如SEQ  ID NO： 1～18所示。 还公开了包括这 些引物的试剂盒， 以及棘头梅童 鱼微卫星荧光多 重PCR的方法。 和上述引物、 试剂盒以及方法在在 评估棘头梅 童鱼遗传多样性方面的应用。 权利要求书2页 说明书9页 序列表4页 附图3页 CN 114921562 A 2022.08.19 CN 114921562 A 1.一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物， 所述SSR多重PCR引物包括9对特异性引物， 分 别为引物对Clu982、 Clu1605、 Clu740、 Clu493、 Clu1563、 Clu873、 Clu1288、 Clu1020和 Clu370， 其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物， 所述9对 特异性引物的碱基序列 依序分别如SEQ  ID NO： 1～18所示。 2.根据权利 要求1所述的于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物， 其特征是： 还包括两条荧光标 记通用引物M13和PQE ‑F， 与所述通用引物M13相配合的荧光标记为5 ‑FAM， 与所述通用引物 PQE‑F相配合的荧光标记为5 ‑HEX， 其中所述通用引物M13、 PQE ‑F的碱基序列分别如SEQ  ID  NO： 19～20所示。 3.一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR的试剂盒， 其特征是： 包括权利要求1所述的9对特 异性引物。 4.一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR的试剂盒， 其特征是： 包括权利要求1所述9对特异 性引物和权利要求2所述两条荧 光标记通用引物M13和PQE ‑F。 5.一种棘头梅 童鱼微卫星荧光多重PCR的方法， 其特 征是包括以下步骤： (1)提取棘头梅 童鱼DNA： 采集 棘头梅童鱼样品的鳍条组织， 提取基因 组DNA； (2)合成特异性引物： 合成所述9对特异性引物， 将所述9对特异性引物分为两组， 分别 为G1组、 G2组， 其中G1组包括引物对Clu982、 Clu1605、 Clu740和Clu493， G2组包括引物对 Clu1563、 Clu873、 Clu128 8、 Clu1020和Clu370； (3)多重PCR扩增： 利用步骤(2)中的两组特异性引物和所述荧光标记通用引物对步骤 (1)中的基因 组DNA进行PCR扩增， 获得扩增产物； (4)遗传多样性评估： 采用毛细管电泳法对扩增产物进行基因分型， 统计每个位点和个 体的等位基因， 根据杂合度指标比较遗传多样性。 6.根据权利 要求5所述的棘头梅童鱼微卫星荧光多重PCR的方法， 其特征是： 步骤(3)中 PCR扩增时， G1组、 G2组的反应 体系分别如下 所示： G1组多重PCR扩增反应 体系为： 权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921562 A 2G2组多重PCR扩增反应 体系为： PCR体系反应物 含量( μL) Clu1563.F(20 μM) 0.06 Clu1563.R(20 μM) 0.24 Clu873.F(5 μM) 0.06 Clu873.R(5 μM) 0.24 Clu1288.F(10 μM) 0.06 Clu1288.R(10 μM) 0.24 Clu1020.F(20 μM) 0.06 Clu1020.R(20 μM) 0.24 Clu370.F(10 μM) 0.06 Clu370.R(10 μM) 0.24 M13(10 μM) 0.36 PQE‑F(10 μM) 0.36 BSA(2mg/mL) 0.45 DNA(50ng/ μL) 2.0 Taq HS(Takara) 12.5 ddH2O 9.83 Total 25.0 。 7.根据权利 要求5所述的棘头梅童鱼微卫星荧光多重PCR的方法， 其特征是： 步骤(3)中 PCR扩增时， 采用的扩增程序为： 98℃10s， 57℃40s， 72℃60s， 35个循环； 98℃10s， 53℃40s， 72℃60s， 15个循环； 最后72℃延伸3 0min。 8.权利要求1或2所述SSR多重PCR引 物、 权利要求3或4所述的试剂盒以及权利要求5 ‑7 任一项所述的方法在评估棘头梅 童鱼遗传多样性方面的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921562 A 3