(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221045242 9.9 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 广州博懿瑞生物科技有限公司 地址 510630 广东省广州市天河区岐山路 548号201-261 (72)发明人 周玲玲　麻昕雨　温清娜　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应 用 (57)摘要 本发明公开了一种自淬灭荧光的引物及其 设计方法及应用。 所述引物的序列含有 “TG”碱 基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基，“TG”碱基、 “GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的T碱基或C碱基 标记有荧光染料； 所述引物的序列不含有 “TG”碱 基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的引物序列， 引物的5’端额外设置有含 “TG”碱基或“GT”碱基 的接头序列， 所述接头序列中 “TG”碱基或“GT”碱 基的T碱基标记有荧光染料， 或者引物的5 ’端额 外设置有含 “CG”碱基或“GC”碱基的接头序列， 所 述接头序列中 “CG”碱基或“GC”碱基的C碱基标记 有荧光染料； 所述引物可自淬灭； 可满足多重检 测的需求。 权利要求书1页 说明书14页 序列表3页 附图6页 CN 114875116 A 2022.08.09 CN 114875116 A 1.一种自淬灭荧光的引物， 其特征在于， 所述引物的序列为16～30个碱基； 所述引物的 序列含有“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基，“TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC” 碱基的T碱基或C 碱基标记有荧 光染料； 所述引物的序列不含有 “TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC”碱基的引物序列， 引物的 5’端额外设置有含 “TG”碱基或“GT”碱基的接头序列， 所述接头序列中 “TG”碱基或“GT”碱基 的T碱基标记有荧光染料， 或者引物的5 ’端额外设置有含“CG”碱基或“GC”碱基的接头序列， 所述接头序列中“CG”碱基或“GC”碱基的C碱基标记有荧 光染料。 2.根据权利要求1所述引物， 其特 征在于， 所述引物的3 ’端无封闭修饰。 3.根据权利要求1所述引物， 其特 征在于， 所述引物长度为18～ 28个碱基。 4.根据权利要求1所述引物， 其特征在于， 所述引物的序列含有 “TG”碱基，“TG”碱基的T 碱基标记有荧光染料； 所述引物的序列不含有 “TG”碱基的引物序列， 引物的5 ’端额外设置 有含“TG”碱基的接 头序列， 所述接 头序列中“TG”碱基的T碱基标记有荧 光染料。 5.根据权利要求1所述引物， 其特 征在于， 所述接 头序列的长度为2 ～10个碱基。 6.根据权利要求1所述引物， 其特征在于， 所述荧光染料为FAM、 VIC、 HEX、 Tamara、 磺酰 罗丹明101、 ROX或C Y5中的任一种。 7.一种自淬灭荧光的引 物的设计方法， 其特征在于， 在含有 “TG”碱基、“GT”碱基、“CG” 碱基或“GC碱基”的引物序列中， 选择 “TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC碱基”的T碱基或C 碱基标记荧光染料； 在不含有 “TG”碱基、“GT”碱基、“CG”碱基或“GC碱基”的引物序列中， 在 引物的5’端额外设置含 “TG”碱基或“GT”碱基的接头序列， 所述接头序列中 “TG”碱基或“GT” 碱基的T碱基标记荧光染料， 或者在引物的5 ’端额外设置含 “CG”碱基或“GC”碱基的接头序 列， 所述接 头序列中“CG”碱基或“GC”碱基的C碱基标记荧 光染料。 8.根据权利要求7 所述设计方法， 其特 征在于， 引物的3 ’端不标记荧 光染料。 9.权利要求1～6任一所述引物在作为 荧光PCR检测引物中的应用。 10.一种非诊断目的PCR方法， 其特征在于， 进行荧光PCR反应， 其中至少一条引物为权 利要求1～6任一所述引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875116 A 2一种自淬灭荧光的引物及其设计方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及荧光PCR技术领域， 更具体地， 涉及一种自淬灭荧光的引物及其设计方 法及应用。 背景技术 [0002]实时荧光PCR检测技术同时具备灵敏度高、 特异性强、 简便快速、 成本低等多种优 点， 是病原 微生物检测最常用的方法。 目前多重荧光P CR方法基于上是荧光探针技术 或荧光 染料法进行检测。 基于荧光探针法的多重P CR技术， 是指在 多重PCR扩增时， 在加入多对引物 的同时加入不同荧光标记的特异 性的探针， 探针的两端分别标记不同的荧光基团和淬灭基 团， 在PCR扩增过程中依赖DNA聚合酶的5 ’ →3’外切酶活性将探针酶切水解， 使荧光基团和 淬灭基团分开， 从而产生不同的荧光信号， 最后根据荧光信号的差别来区分所检测物质； 缺 点是， 相同荧光通道不能区分不同的检测物质、 检测突变的能力不 足、 不能进 行溶解曲线分 析。 基于荧光染料的多重P CR检测方法， 是指在 多重PCR扩增时加入荧光染料， 然后进行熔解 曲线分析， 根据不同检测物质TM值的不同来区分相应的检测物质， 缺点是， 只能进 行单通道 检测， 容易产生非特异性。 [0003]查阅国内外相关的基于自淬灭荧光引物检测技术的专利及文献， 目前有基于自淬 灭荧光引物或探针的专利和文献， 现有技术淋球奈瑟菌荧光定量PCR检测试剂盒介绍了一 种自淬灭引物， 该自淬灭引物是一种颈环结构的引物， 引物3 ’端的5个碱基会5 ’端的碱基自 身配对， 其中3 ’端的第二个碱基(T碱基)标记有FAM荧光素； 但是该自淬灭引物中颈环结构 中的G碱基与C碱基对结合， 会大大降低G碱基的淬灭性能， 使自淬灭引物的本身背 景信号增 强， 增加了检测时的难度； 且 该自淬灭引物进行P CR检测时， 不能用于溶解曲线分析， 因为其 引物自身存在双链结构， 会释放荧光信号， 从而造成非特异 性的溶解曲线峰图； 同时该自淬 灭引物有明显的二级结构， 会影响PCR的扩增效率。 现有技术(Zhang  Y,Wei Y,Yang S,et  al.Rapid  and accurate  identification  of SARS‑CoV‑2 variants  containing  E484  mutation.2021.)公开了利用鸟嘌呤自淬灭的原理， 但其是利用该原理制备自淬灭的 TaqMan荧光探针， 是一种自淬灭探针荧光PCR技术， 该方法需额外设计TaqMan探针， 增加设 计的难度； 同时该方法不能进行溶解曲线分析， Taq酶会把探针水解掉， 不会形成有荧光信 号的双链产物。 [0004]因此， 十分有必有研究一种能利用相同荧光通道区分不 同检测物质、 能进行溶解 曲线分析、 单通道检测也具有特异性、 检测难度低、 扩增效率更高的PCR检测方法。 发明内容 [0005]本发明要解决的技术问题是克服现有荧光PCR技术的不足， 提供一种自淬灭荧光 的引物及其设计方法及应用。 [0006]本发明的第一个目的是提供一种自淬灭荧 光的引物。 [0007]本发明的第二个目的是提供一种自淬灭荧 光的引物的设计方法。说　明　书 1/14 页 3 CN 114875116 A 3