(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210458391.6 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 青岛海水稻研究发展中心有限公司 地址 266041 山东省青岛市李沧区金 水路 171号16号楼 (72)发明人 刘佳音　李儒剑　万吉丽　王克响　 尹晓佳　李霞　于萌　殷会德　 顾晓振　米铁柱　 (74)专利代理 机构 山东三邦知识产权代理事务 所(普通合伙) 37308 专利代理师 牛继梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测常规水稻种子纯度的试剂盒及检 测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测常规水稻种子 纯度的试剂盒及检测方法， 属于常规水稻种子纯 度检测技术领域。 本发明用于检测常规水稻种子 纯度的试剂盒包括PCR  mix和SSR引物； PCR  mix 所含成分为： 3mM  MgSO4， 100mM KCl， 20mM  pH  8.0Tris‑HCl， 10mM EDTA， 0.4mMdNTPs， 0.0 4U/μ L Taq DNA聚合酶， 3％二甲基亚砜， 12％甘油， 0.02％溴酚蓝， 0.02％二甲苯腈蓝 FF； 所述SSR引 物序列如SEQ  ID NO:1‑SEQ ID NO:40所示。 采用 本发明的试剂盒检测常规水稻种子纯度准确性 高， 节省人力和成本， 提高了种子纯度鉴定的效 率。 权利要求书2页 说明书9页 序列表7页 附图2页 CN 114606343 A 2022.06.10 CN 114606343 A 1.一种用于检测常规水稻种子纯度的试剂 盒， 其特征在于， 包括扩增水稻20个SSR标记 的引物序列； 所述20个S SR标记如下： 第一个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组1号染色体832 9860‑8330052位置； 第二个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组2号染色体876 0433‑8760557位置； 第三个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组3号染色体3 6348164‑36348246位置； 第四个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组4号染色体189 96785‑18996891位置； 第五个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组10号染色体9818621 ‑9818784位置； 第六个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组12号染色体243 3238‑2433453位置； 第七个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组1号染色体6154019 ‑6154166位置； 第八个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组2号染色体3 5141668‑35141836位置； 第九个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组5号染色体3 6910796‑26910946位置； 第十个SSR标记位于水稻日本晴参 考基因组7号染色体21872196 ‑21872349位置； 第十一个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组8号染色体676 3702‑6763889位置； 第十二个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组9号染色体78 88400‑7888602位置； 第十三个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组3号染色体975 5616‑9755778位置； 第十四个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组4号染色体21414515 ‑21414681位置； 第十五个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组6号染色体5426496 ‑5426630位置； 第十六个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组7号染色体287616 5‑2876333位置； 第十七个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组8号染色体17945 061‑17945202位置； 第十八个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组9号染色体193202 99‑19320450位置； 第十九个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组10号染色体1808549 9‑18085630位置； 第二十个S SR标记位于水稻日本晴参 考基因组11号染色体2767325 0‑27673372位置。 2.根据权利要求1所述用于检测常规水稻种子纯度的试剂 盒， 其特征在于， 所述扩增水 稻20个SSR标记的引物序列如SEQ  ID NO:1‑SEQ ID NO:40所示。 3.根据权利要求1所述用于检测常规水稻种子纯度的试剂 盒， 其特征在于， 还包括用于 扩增水稻20个S SR标记的反应 体系溶液PCR mix。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的试剂盒在检测常规水稻种子纯度中的应用。 5.一种检测常规水稻种子纯度的方法， 其特 征在于， 步骤如下： (1)从待测的常规水稻种子 中， 随机抽取一定数量的种子作为检测对象； 提取待检测水 稻种子样品的DNA， 将所提样品的DNA编号， 每5 ‑10粒种子DNA为1组进行等量混样， 获得多个 DNA混池， 分别以这些混池为模板， 采用权利要求1 ‑3任一项的试剂盒进行检测； (2)筛选出步骤(1)中针对于某一或某些SSR标记初步检测有差异扩增的混池； 对该混 池中的所有的样品单独进 行针对该差异SSR标记的检测； 最 终确定对该SSR标记有差异扩增 的单株编号； (3)判断“假种子”： 如果一粒种子的DNA在2个及以上位点扩增出与品种标准材料或绝 大多数种子存在差异的条带， 则该种子非此品种的种子， 为 “假种子”； 如果一粒种子的DNA 在0个或1个位点扩增出与品种标准材料或绝大多 数种子存在差异的条带， 则该种子为此品 种种子或疑似此品种 种子；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114606343 A 2(4)计算种子纯度： 种子纯度为该品种种子或疑似该品种种子数与检测种子总数的百 分比， 根据上述(3)中的判断结果， 计算待测常规水稻种子的纯度。 6.根据权利要求5所述检测常规水稻种子纯度的方法， 其特征在于， 提取待检测水稻种 子样品DNA的方法如下： 将100mg的水稻材料置于离心管中， 同时加入100 μL裂解液， 研磨破碎； 然后将离心管置 于沸水中水浴10min； 水浴结束后加入中和液10 ×TE buffer 100μL混匀， 12000rpm离心 10min； 上清液即为 提取的DNA样品； 其中， 所述裂解液成分为0.1M  KOH、 2％吐温20； 所述中和液10 ×TE buffer成分为 100mM Tris‑HCl和10mM EDTA‑Na2。 7.根据权利要求6所述检测常规水稻种子纯度的方法， 其特征在于， 所述水稻 材料为水 稻幼苗叶片、 萌发后的水稻幼芽或蒸馏水浸泡过夜的水稻种子 。 8.根据权利要求5所述检测常规水稻种子纯度的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中采 用权利要求1 ‑3任一项的试剂盒进行检测的方法是以提取的DNA混池为模板， 分别对20个 SSR分子标记进行检测， 配制PCR反应体系， 进行PCR反应； 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩 增结果。 9.根据权利要求8所述检测常规水稻种子纯度的方法， 其特征在于， 所述PCR采用10μL 体系， 具体包 含PCRmix 5 μL， 10 μM的前后引物各0.5 μL， 1 μL 提取的DNA， 3 μL的水。 10.根据权利要求8所述检测常规水稻种子纯度的方法， 其特征在于， 所述PCR反应程序 为： 94℃预变性5min； 94℃变性30s， 50 ‑65℃退火30s， 72℃延伸30s， 循环28 ‑33次； 72℃延伸 7min； 10℃保存。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114606343 A 3