(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210456826.3 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 南通大学 地址 226019 江苏省南 通市崇川区啬园路9 号 (72)发明人 汪保华　孙康泰　庄智敏　方辉　 王凯　韩金磊　季美君　冯汶祥　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花 耐盐基因发现方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及植物遗传技术领域， 尤其涉及一 种基于转录组和 蛋白组联合分析的棉花耐盐基 因的发现方法及其应用， 本发明以陆地棉耐盐品 种通盐一号为材料， 对其开展盐胁 迫及对照下的 转录组测序和蛋白组测序， 通过二者联合分析初 步确定耐盐候选基因， 并对耐盐差异基因进行 RT‑qPCR表达分析， 最后 在棉花中开展功能验证。 本发明得到的两个棉花耐盐基因Gh_D10G09 07和 Gh_D11G0978分别位于棉花D10和D11号染色体； 利用这两个基因， 可分子标记辅助选育耐盐棉花 品种。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 114634993 A 2022.06.17 CN 114634993 A 1.一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉花耐盐基因的发现方法， 其特征在于， 所述 棉花耐盐基因包括棉花耐盐基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因Gh_D11G0978， 所述棉花耐盐 基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因Gh_D1 1G0978分别位于棉花D1 1和D10号染色体。 2.根据权利要求1所述的一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉 花耐盐基因 的发现方 法， 其特征在于， 所述棉花耐盐基因Gh_D 10G0907和棉 花耐盐基因Gh_D11G0978的cDNA序列 信息如下： >Gh_D10G0907.1 ATGGCTTCAGTGAATCTGGGCTCTTTGGTTCAATCATACTCCATTTTCAACCAAGCTTCCAGAAACAATTCCA AGTCTTTTCCTTTACCCAGATCCTTTCCCTTCAATCCCCTCAAGAATATCTCATCTTCAACTCCCAAAAGACGTAGC TTTACATCTCTTCCTTCGATATCCTCAGTCCTTACCAAAGAAGACGCGGTCATGGAAGAAGACCAAGACCCTCAATT ACCAAGTTTTGATTTCAAATCATTCATGATACACAAGGGTAATGCAGTTAACCAAGCCCTGGACTCGGCTGTTCCAC TCCGTGACCCTGTTAAAATCCATGAAGCAATGCGTTACTCCCTTTTAGCCGGTGGCAAAAGGGTCCGCCCAGTTCTT TGTTTGGCTGCTTGTGACCTTGTTGGTGGCAAAGAATCCATGGTTATGCCAGCAGCTTGTGCTCTTGAAATGATCCA CACCATGTCTTTAGTCCACGATGATCTTCCTTGCATGGACAACGATGATCTTCGTAGAGGGAAACCAACTAACCACA AAGTTTATGGTGAAGATATAGCTGTGTTAGCAGGGGATGCTCTTTTAGCCTTTTCGTTTGAACATATAGCTGTATCC ACAGTTGGTGTCACACCTGATAGGATTGTAAGAGCAATTGGGGAATTAGCTAAATCTATTGGGGCTGAAGGGTTGGC GGCTGGTCAAGTTGTGGATATAACCAGTGAGGGTCTAACCAATGTGGGGTTGGATCATTTAGAATTCATTCATGTTC ATAAAACTGCTCCATTGCTTGAAGCAGCTGCGGTTTTAGGGGCTATTCTTGGAGGTGGACATGATGAAGATGTGGAA AAGTTGAGGAAATTTGCAAGGAATATTGGGCTTTTATTTCAAGTTGTGGATGATATTCTTGATGTAACAAAGTCATC TAAAGAATTAGGGAAGACTGCAGGGAAAGATTTGGTGGCTGATAAAGTGACTTATCCTAAATCGATGGGGATAAACA AATCAAAGGAGTTTGCAGAGAAGTTGAAGAGTGATGCATTAGAGTTGCTTCAAGGGTTTGATCCTGAGAAATCTACC CCCTTAATTGCTTTAGCTAATTATATAGCT TACAGGCAAAATTAG >Gh_D11G0978.1 ATGTCGCAGTTGTTGGAGAAGGCGAAGGACTTCGTGGTGGATAAGGTGGCCAACATAAAGAAGCCGGAGGCT AGTGTCTCGGACGTTGATCTGAAACATGTGA GCCGTGAGTGCGTCGA GTATGGCGCTAA GGTCTCTGTCTCCAACC CCTACAGCCATTCCATCCCCATTTGTGA GATCTCTTACAATTTCAAAA GTGCTGGAAGA GGGATAGCATCAGGGAC AATACCAGACCCGGGGTCATTGAAAGCCGGCGACACAACGATGCTGGACGTGCCA GTGAAGGTGCCGTATAACATC TTAGTAAGCTTGGCAAA GGATATTGGTGCA GATTGGGACATTGACTATGAATTGGAATTGGGTCTCACCATTGATC TTCCTATCATGGGGAACTTCACTATCCCTCTCTCTCA GAAAGGAGAGATCAAGCTTCCTACTCTCA GTGACATCTT TTAG。 3.根据权利要求1所述的一种基于转录组和蛋白组联合分析的棉 花耐盐基因 的发现方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1、 蛋白组与转录组测序及联合分析； 种植耐盐棉花品种， 相同环境下当棉花幼苗生长到四叶期时， 选取6株生长状态良好且 形态相近的幼 苗分为两组， 一组为对照组， 一组为实验组， 实验组每天下午5点浇250mmol/l 的NaCl溶液200ml； 对照组浇等量的蒸馏水， 两天后， 将对照组三株分别取真叶标记为CK1、 CK2、 CK3， 同样将实验组3株分别取真叶标记为Salt1、 Salt2、 Slat3， 最后将6个样进行干冰 冷冻然后分别提取RNA进行转录组测序、 提取蛋白进行蛋白组测序； 通过对转录组与蛋白组的联合分析， 一共得到24个共性的差异表达基因， 这24个基因权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114634993 A 2在转录组与蛋白组结果中均显著差异表达； 通过对目的基因的注释与比对， 盐胁迫前后表 达量差异倍数比对， 并且对基因功能进行总结， 得到两个显著差异表达的基因Gh_D10G0907 与Gh_D11G0978， 将这两个 基因确定作为目的基因， 并对其耐盐功能进行验证； 步骤2、 耐盐基因的表达模式验证； 步骤2.1、 对于上述耐盐候选基因， 利用Primer5进行引物的设计并合成， 将RNA反转录 为cDNA， 利用实时定量PCR进行表达模式验证； 步骤2.2、 在棉花中开展候选基因的基因克隆与基于病毒介导沉默的功能验证， Gh_ D10G0907全长1119bp编码氨 基酸372个， 属于GGPS家族； Gh_D11G0978 全长456bp编码氨 基酸 151个， 属于LEA家族； 这两个家族在不同的物种中均有耐盐性相关验证； 用V IGS技术获得了 Gh_D10G0907和Gh_D11G0978的基因沉默植株， 对沉默植株进行盐处理后， 沉默植株出现早 枯萎与较大程度的盐害表型； 而且沉默植株对比对照组活性氧含量更高； 则认为这两个基 因在陆地棉盐胁迫下有着重要的作用。 4.一种采用权利要求3所述的发现方法的棉花耐盐基因Gh_D10G0907和棉花耐盐基因 Gh_D11G0978在分子标记辅助选 育棉花品种中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114634993 A 3