(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210453810.7 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 青岛农业大 学 地址 266000 山东省青岛市城阳区长城路 (72)发明人 范银君　付冠军　秦雨　刘美汐　 周洪旭　张昌振　万方浩　 (74)专利代理 机构 北京识然知识产权代理事务 所(普通合伙) 11975 专利代理师 曾庆国 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测具有耐AChE抑制剂性状的桔小实 蝇的方法 (57)摘要 本发明提供一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶 AChE抑制剂性状的引物组和检测方法。 所述的引 物组包括检测野生型桔小实蝇的引物对和检测 突变型桔小实蝇的引物对； 其中所述的检测野生 型桔小实蝇的引物对， 其扩增的核苷 酸片段的序 列为SEQ ID NO： 1， 所述的检测突变型桔小实蝇 的引物对， 是检测具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性 状的桔小实蝇的引物对， 其扩增的核苷酸片段的 序列为SEQ  ID NO： 2。 本发明的方法可直接根据 电泳图谱准确鉴别待检测个体是否为具有耐乙 酰胆碱酯酶AChE抑制剂性状的突变位点的野生 型、 纯合型或杂合型桔小实蝇； 从而为桔小实蝇 的科学防治、 合理选药提供准确的判定标准。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114672577 A 2022.06.28 CN 114672577 A 1.一种引物组， 其特征在于， 所述的引物组包括检测野生型桔小实蝇的引物对和检测 突变型桔小实蝇的引物对； 其中所述的检测野生型桔小实蝇的引物对， 其扩增的核苷酸片 段的序列为SEQ  ID NO： 1， 或在SEQ  ID NO： 1上经过取代、 缺失、 添加一个或数个核苷， 由SEQ   ID NO： 1衍生的片段； 所述的检测突变型桔小实蝇的引物对， 是检测具有耐乙酰胆碱酯 酶抑制剂性状的桔小 实蝇的引物对， 其扩增的核苷酸片段的序列为SEQ  ID NO： 2； 或在SEQ  ID NO： 2上经过取代、 缺失、 添加一个或数个核苷， 由SEQ  ID NO： 2衍生的片段。 2.如权利要求1所述的引物组， 其特征在于， 所述的引物 组还包含有用于质控功能的引 物对； 其扩增的序列的核苷酸序列为SEQ  ID NO： 3。 3.如权利要求2所述的引物组， 其特征在于， 所述的用于质控功能的引物对， 其上游引 物的序列为SEQ  ID NO： 4； 下游引物的序列为SEQ  ID NO： 5。 4.如权利要求1所述的引物组， 其特征在于， 所述的检测野生型桔小实蝇的引物对， 其 上游引物序列为SEQ  ID NO： 6， 下游引物序列为SEQ  ID NO： 5。 5.如权利要求1所述的引物组， 其特征在于， 所述的检测突变型桔小实蝇的引物对， 其 上游引物序列为SEQ  ID NO： 7， 下游引物序列为SEQ  ID NO： 5。 6.一种ASPCR扩增检测试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中包含有权利要求1 ‑5任一 项所述的引物组。 7.一种检测具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的桔小实蝇的方法， 其特征在于， 所述的 方法是使用权利要求1 ‑5任一项所述的引物组进行检测； 其检测步骤如下： 1)提取待检测的桔 小实蝇成虫的基因 组DNA； 2)利用上述的引物组对提取的待检测的桔 小实蝇基因 组DNA进行PCR扩增； 其中序列为SEQ  ID NO： 4、 SEQ  ID NO： 5和SEQ  ID NO： 6的引物组合作为第一引物组合 在一个反应中进行扩增， 而序列为SEQ  ID NO： 4、 SEQ ID NO： 5和SEQ  ID NO： 7的引物组合作 为第二引物组合在另一个反应中进行扩增； 3)将步骤2)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 通过电泳图谱与鉴定标准来比 较， 确定所检测的桔 小实蝇是否具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的检测方法中， PCR反应体系为25μL:10 ×rTaq Buffer 2.5 μl， 10mM  dNTP 2 μl， 单头桔小实蝇样本的基因组DNA  1 μl， 20 μM引物0.5 μl， 5U/ μlr  Taq酶0.25 μl， d dH2O补至25 μl。 9.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述的检测方法中， PCR反应程序如下： 94℃ 预变性3min； 94℃变性30s： 72℃开始退火， 每个循环下降1℃， 72℃延伸30s， 进行12 个循环， 然后在60℃条件下 退火， 72℃延伸3 0s， 进行2 2个循环， 每个循环30s； 72℃延伸7mi n。 10.如权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述的鉴定标准如下： 如果第一引物组合的PCR产物， 电泳图谱显示500和400bp两个条带； 第二引物组合的 PCR产物图谱只有500b p的条带， 则表明检测的桔小实蝇个体为不具有耐乙酰胆碱酯酶AChE 抑制剂性状的突变位 点的纯合野生型桔 小实蝇； 如果第一引物组合和第二引物组合的PCR产物图谱均含有500和400bp的条带、 则表明 检测的桔 小实蝇个 体为具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的突变位 点的杂合型桔 小实蝇； 如果第一引物组合的PCR产物图谱只有500bp条带， 而第二引物组合的PCR产物图谱有权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114672577 A 2500和400b p的条带， 则表明检测桔小实蝇个体为具有耐乙酰胆碱酯酶抑制剂性状的突变位 点的纯合型桔 小实蝇。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114672577 A 3