(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221045915 6.0 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 哈尔滨医科 大学 地址 150086 黑龙江省哈尔滨市南岗区保 健路157号 (72)发明人 赵亚双　张磊　李大鹏　崔滨滨　 付庆臻　高立晶　谭世恒　 (74)专利代理 机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 1 1139 专利代理师 马鑫 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一组与结直肠癌相关的特异性甲基化标志 物及其检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一组与结直肠癌相关的特异 性甲基化标志物及其检测试剂盒。 所述的甲基化 标志物为位于B3GALNT1、 C6orf97、 FAM72A、 FAM72B、 LIFR、 OSMR、 Z NF264及ZNF543基因上的15 个目标CpG位点。 该 15个CpG位点相比于其他类 型 的癌症组织在结直肠癌组织中呈现特异性高甲 基化状态。 本发明首次在结直肠癌血浆cfDNA中 检测了其中10个CpG位点的甲基化水平， 通过优 化引物、 探针及反应体系， 建立了三个多重数字 PCR检测体系， 该检测方法的检测灵敏度明显优 于常规MethyLight检测方法， 检测下限可达到 0.032％。 多重 数字PCR通过计算每毫 升血浆中的 甲基化分子拷贝数对该7个扩增片段的甲基化水 平进行定性和定量， 结果表明其具有成为结直肠 癌无创诊断标志物的潜力， 同时具有一定的识别 结直肠腺瘤 及区分其 他肿瘤患者的能力。 权利要求书3页 说明书13页 附图5页 CN 114908166 A 2022.08.16 CN 114908166 A 1.与结直肠癌相关的特异性甲基化标志物， 其特征在于， 所述的甲基化标志物为含有 至少一个CpG甲基化位点的B3GALNT1， C6orf97， FAM72A， FAM72B， LIFR， OSMR， ZNF264或 ZNF543基因序列或其片段， 或是 所述的基因序列或其片段的任意组合； 根据450K芯片的基因组注释信息(GRCh37/hg19)， 其中在B3GALNT1基因上存在1个CpG 位点， 即cg2084190 6， 位于第3号染色体反链的第16 0822911核苷酸处； 其中在C6orf97基因上存在1个CpG位点， 即cg00117463， 位于第6号染色体正链的第 151815241核苷酸处； 其中在FAM72A基因上存在2个CpG位点， 分别为cg00552973和cg10439914， cg00552973 位于第1号染色体反链的第206137054核苷酸处， cg10439914位于第1号染色体正链的第 206137759核苷酸处； 其中在FAM72B基因上存在6个CpG位点， 分别为cg07784526、 cg18948743、 cg08728856、 cg00198436、 cg07236150以及cg09169215， cg07784526位于第1号染色体正链的第 120838320核苷酸处， cg18948743位于第1号染色体正链的第120838323核苷酸处， cg08728856位于第1号染色体正链的第120838718核苷酸处， c g00198436位于第1号染色体 反链的第12 0839380核苷酸处， cg07236150位于第1号染色体 反链的第120839385核苷酸处， cg09169215位于第1号染色体反链的第120839390核苷酸处； 其中在LIFR基因上存在1个CpG位点， 即cg18174928， 位于第5号染色体正链的第 38557085核苷酸处； 其中在OSMR基因上存在1个CpG位点， 即cg17528648， 位于第5号染色体正链的第 38846100核苷酸处； 其中在ZNF264基因上存在2个CpG位点， 分别为cg26970847和cg11140785， cg26970847 位于第19号染色体反链的第57702793核苷酸处， cg11140785位于第19号染色体反链的第 57703301核苷酸处； 其中在ZNF543基因上存在1个CpG位点， 即cg14786398， 位于第19号染色体反链的第 57831816核苷酸处。 2.一种用于结直肠癌相关基因甲基化检测的数字PCR试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 包括用于 结直肠癌相关基因FA M72A、 FAM72B、 LIFR、 OSMR、 ZNF2 64以及ZNF543基因CpG甲基化 位点检测的数字PCR引物以及探针的组合， 试剂盒内还包含需要校正上样量的内参基因 ACTB基因扩增片段 所需的引物对及探针， 所述的引物及探针序列如下 所示：权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114908166 A 2其中， FAM72A引物对用于扩增FAM72A基因片段， 探针用于检测该基因片段上存在的1个 CpG位点， 即c g00552973， 位于第1号染色体反链的第206137054核苷酸处； FAM72B_1引物对 用于扩增FAM72B基因片段， 探针用于检测该基因片段上存在的2个CpG位点， 分别为 cg07784526和cg18948743， cg07784526位于第1号染色体正链的第120838320核苷酸处， cg18948743位于第1号染色体正链的第120838323核苷酸处； FAM72B_2引物对用于扩增 FAM72B基因片段， 探针用于检测该基因片段上存在的3个CpG位点， 分别为cg00198436、权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114908166 A 3