(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210459339.2 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 杭州瑞普基因科技有限公司 地址 311100 浙江省杭州市余杭区五常街 道联创街18 8号贝达梦工场D座7-10层 (72)发明人 任文静　周焕焕　濮悦　王涛　 (74)专利代理 机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11201 专利代理师 张娜 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) (54)发明名称 用于FGFR4基因表达水平检测的组合物、 试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提出了用于FGFR4基因表达水平检测 的组合物、 试剂盒及其应用， 该组合包括引物组 和探针组， 所述引物组包括第一对引物， 其中： 第 一 对 引 物 上 游 序 列 包 括 ：5 ’ ‑ TCCCTGGAGGCCTCTGAG ‑3’(SEQ ID NO:1)， 第一对 引物下游序列包括： 5 ’ ‑TCTTGCTGCTCCAGGCT ‑3’ (SEQ ID NO:2)； 所述探针组包括第一探针， 其 中： 第一探针序列包 括： 5’ ‑AGCTTGAGCCCTGCC ‑3’ (SEQ ID NO:3)。 利用本发明提出的组合物可以 高效准确的对样品中的FGF R4基因的表达量进行 检测， 并利用获得的结果指导临床治疗或进行科 学研究。 权利要求书2页 说明书11页 附图2页 CN 114934042 A 2022.08.23 CN 114934042 A 1.一种组合物， 其特 征在于， 包括引物组和探针组， 所述引物组包括第一对引物， 其中： 第一对引物上游序列包括： 5 ’ ‑TCCCTGGAGGCCTCTGAG‑3’(SEQ ID NO:1)， 第一对引物下游序列包括： 5 ’ ‑TCTTGCTGCTC CAGGCT‑3’(SEQ ID NO:2)； 所述探针组包括第一探针， 其中： 第一探针序列包括： 5 ’ ‑AGCTTGAGCCCTGCC‑3’(SEQ ID NO:3)。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述引物组进一步包括第二对引物， 其 中： 第二对引物上游序列包括： 5 ’ ‑CATCGCATA AGAGCAAAGAACACTG‑3’(SEQ ID NO:4)， 第二对引物下游序列包括： 5 ’ ‑GCAGCTGA AGTAGGTGCG‑3’(SEQ ID NO:5)； 所述探针组进一 步包括第二探针， 其中： 第二探针序列包括： 5 ’ ‑CCACAGGAGGCTACG‑3’(SEQ ID NO:6)。 3.根据权利要求1 ‑2任一项所述的组合物， 其特征在于， 所述探针组中的探针进一步携 带荧光基团， 所述第一探针携带第一荧光基团， 第二探针携带第二荧光基团， 且第一、 第二 荧光基团不同； 任选地， 所述荧光基团选自下列中的至少之一： FAM、 ROX、 VIC、 CY5、 CY3、 HEX、 5 ‑TAMRA、 TET和JOE 。 4.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述探针组中的探针的5 ’端标记荧光基 团， 3’端标记淬灭基团， 优选地， 所述第一探针5 ’端标记FAM荧 光报告基团， 3 ’端标记MGB淬灭基团； 优选地， 所述第二探针5 ’端标记VIC荧光报告基团， 3 ’端标记MGB淬灭基团。 5.一种试剂盒， 其特 征在于， 包 含权利要求1 ‑4任一项所述的组合物。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 进一步包括下列中的至少一种： PCR缓冲 液、 盐离子、 dNTPs、 DNA聚合酶 或者靶标核酸； 任选地， 所述试剂盒进一 步包括逆转录酶； 任选地， 进一 步包括PCR增强剂； 任选地， 所述DNA聚合酶为Taq酶； 任选地， 所述盐离 子为Mg2+。 7.根据权利要求5 ‑6任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 进一步包括下列 试剂中的至少 一种： RNA提取 试剂和核酸纯化试剂。 8.一种检测样品中基因表达量的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将待测样品在PCR扩增体系中进行扩增反应， 所述PCR扩增体系中包括权利要求1 ‑4任 一项所述的组合物或利用权利要求5 ‑7任一项所述的试剂盒配置的， 其中， 所述待测样品中 包括cDNA。 任选地， 所述待测样品预先采用逆转录反应体系进行逆转录反应， 所述逆转录反应体 系是利用权利要求1 ‑4任一项所述的组合物或权利要求5 ‑7任一项所述的试剂盒配置的； 任选地， 所述待测样品预 先经过RNA提取； 任选地， 将所述待测样品在PCR扩增体系中进行扩增反应， 以便获得待测基因的CT值； 任选地， 基于所述待测基因的CT值， 确定待测样品中待测基因的表达量；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114934042 A 2任选地， 所述待测样品来源于实验样品和/或对照样品的； 任选地， 所述待测基因包括FGFR4基因。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述的逆转录反应体系包括权利要求1 ‑4 任一项所述的组合物， 其中， 基于20 μL的反应体系， 所述组合物中的第一对引物、 第二对引 物的用量 为1‑3 μL； 任选地， 所述逆转录反应体系包括权利要求1 ‑4任一项所述的组合物， 其中， 所述第一 对引物上游序列、 第一对引物下游序列、 第二对引物上游序列、 第二对引物下游序列的摩尔 比为(0.5 ‑1.2)： (0.5 ‑1.2)： (0.5 ‑1.2)： (0.5 ‑1.2)； 优选地， 所述逆转录反应体系包括权利要求1 ‑4任一项所述的组合物， 其中， 所述第一 对引物上游序列、 第一对引物下游序列、 第二对引物上游序列、 第二对引物下游序列的摩尔 比为1： 1： 1： 1。 10.根据权利要求8 ‑9任一项所述的方法， 其特征在于， 所述逆转录反应条件依次为： 20 ℃‑30℃、 1‑3min， 50℃‑60℃、 8‑13min， 90℃‑98℃、 0.5 ‑1.5min。 11.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增体系包括权利要求1 ‑4任一 项所述的组合物， 其中， 基于20 μL的反应体系， 所述组合物中的第一对引物的用量为3 ‑5 μL， 第一探针的用量 为0.5‑2 μL， 第二对引物的用量 为3‑5 μL， 第二探针的用量 为0.5‑2 μL； 任选地， 所述PCR扩增体系包括权利 要求1‑4任一项所述的组合物， 其中， 基于20 μL的反 应体系， 所述组合物中的第一对引物的上游序列的用量为 1‑2 μL， 第一对引物的下游序列的 用量为1.5 ‑2.5 μL， 第一探针的用量为0.5 ‑2 μL， 第二对引物的上游序列用量为0.2 ‑0.8 μL， 第二对引物的下游序列用量 为1.5‑3 μL， 第二探针的用量 为0.5‑2 μL； 任选地， 所述PCR扩增体系包括权利 要求1‑4任一项所述的组合物， 其中， 所述组合物中 的第一对引物的上游序列、 第一对引物的下游序列、 第一探针、 第二对引物的上游序列、 第 二对引物的下游序列、 第二探针的摩尔比为(7 ‑9)： (9‑11)： (4‑6)： (1‑3)： (9‑11)： (1‑3)； 优选地， 所述PCR扩增体系包括权利 要求1‑4任一项所述的组合物， 其中， 所述组合物中 的第一对引物的上游序列、 第一对引物的下游序列、 第一探针、 第二对引物的上游序列、 第 二对引物的下游序列、 第二探针的摩尔比为8： 10： 5： 2： 10： 2。 12.根据权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增反应的条件依次为： 90℃ ‑97 ℃、 25‑35s， 90℃‑97℃、 10‑20s， 57‑65℃、 30‑40s， 38‑41个循环。 13.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述待测样品包括选自组织样品、 细胞样 品、 血液样品、 分泌物或者 排泄物中的至少一种； 任选地， 所述 排泄物包括粪便、 尿液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114934042 A 3