(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210462580.0 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 常州市食品药品 纤维质量 监督检验 中心 地址 213000 江苏省常州市新北区河海西 路106号 申请人 四川华汉三创生物科技有限公司 (72)发明人 杨丹妮　贾卫昌　耿成钢　高蕙文　 袁荷芳　张晓金　邹雨虹　蒋静娴　 李文静　周航　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 王志 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探 针及其制备方法 (57)摘要 本申请公开了一种检测即食果蔬中致病微 生物的引物探针及其制备方法， 所述引物探针为 由以下引物探针组组合获得的多重引物探针组： 用于检测细菌内参的引物探针组A， 用于检测沙 门氏菌的引物探针组B， 用于检测大肠O157的引 物探针组C， 用于检测金黄色葡萄球菌的引物探 针组D， 用于检测单增李斯特菌的引物探针组E， 用于检测轮状病毒的引物探针组F， 用于检测诺 如病毒GI型的引物探针组G， 用于检测诺如病毒 GII型的引物探针组H， 用于检测病毒外参的引物 探针组I。 旨在解决现有技术对即食果蔬中的致 病微生物筛检效率低的问题。 权利要求书3页 说明书22页 附图5页 CN 114774587 A 2022.07.22 CN 114774587 A 1.一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针， 其特征在于， 为由以下引物探针组组 合获得的多重引物探针组： 用于检测细菌内参的引物探针组A， 所述引物探针组A包括引物A1、 引物A2和探针A； 其 中， 引物A1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 引物A2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 探 针A的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 用于检测沙门氏菌的引物探针组B， 所述引物探针组B包括引物B1、 引物B2和探针B； 其 中， 引物B1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 引物B2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 探 针B的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测大肠O157的引 物探针组C， 所述引 物探针组C包括引 物C1、 引物C2和探针C； 其 中， 引物C1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示， 引物C2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示， 探 针C的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示； 用于检测金黄色葡萄球菌的引物探针组D， 所述引物探针组D包括引物D1、 引物D2和探 针D； 其中， 引物D1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示， 引物D2的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.11所示， 探针D的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 用于检测单增李斯特菌的引物探针组E， 所述引物探针组E包括引物E1、 引物E2和探针 E； 其中， 引物E1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示， 引物E2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14 所示， 探针E的核苷酸序列如SEQ  ID NO.15所示； 用于检测轮状病毒的引物探针组F， 所述引物探针组F包括引物F1、 引物F2和探针F； 其 中， 引物F 1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示， 引物F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所示， 探针F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.18所示； 用于检测诺如病毒GI型的引物探针组G， 所述引物探针组G包括引物G1、 引物G2和探针 G； 其中， 引物G1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.19所示， 引物G2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20 所示， 探针G的核苷酸序列如SEQ  ID NO.21所示； 用于检测诺如病毒GII型的引物探针组H， 所述引物探针组H包括引物H1、 引物H2和探针 H； 其中， 引物H1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.22所示， 引物H2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.23 所示， 探针H的核苷酸序列如SEQ  ID NO.24所示； 用于检测病毒外参的引物探针组I， 所述引物探针组I包括引物I1、 引物I2和探针I； 其 中， 引物I1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.25所示， 引物I2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.26所示， 探针I的核苷酸序列如SEQ  ID NO.27所示。 2.一种如权利要求1所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： 获取目的检测靶标； 对所述目的检测靶标进行序列分析， 获得目的序列组； 基于所述目的序列组， 获得 备选引物组； 根据备选引物的序列组， 获得 特异杂交探针组； 将所述备选引物组和所述特异杂交探针组进行优化处 理， 获得多重引物探针组。 3.根据权利要求2所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述对所述目的检测靶标进行序列分析， 获得目的序列的步骤， 包括： 对所述目的检测靶标进行序列分析， 获得 特异序列片段作为目的序列。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114774587 A 24.根据权利要求2所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述基于所述目的序列， 获得 备选引物的步骤， 包括： 基于所述目的序列， 设计获得第一备选引物； 采用标准模板对所述第一备选引物进行扩增效率测试， 获得第二备选引物； 将所述第二备选引物以非目的检测靶标为模板进行 特异性测试， 获得第三备选引物。 5.根据权利要求4所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述PCR扩增的体系组分及比例包括： 1U/ μL的UNG酶0.02 μL； 10mM的dNTPs试剂1.3 μL， 所述的dNTPs试剂包括dATP、 dT TP、 dCTP、 dGTP、 dU TP； 5U/ μL的反转录酶、 Taq  DNA聚合酶混合液0.5 μL； 2倍浓度的PCR缓冲液10 μL， 所述PCR缓冲液中包 含Mg2+； 引物mix； 核酸模板2 ‑5 μL； 其余为无酶水。 6.根据权利要求5所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述PCR扩增的程序为： 45℃下反应3 0min， 循环1次； 95℃下反应2mi n， 循环1次； 94℃下反应3 0s、 55℃下反应3 0s和72℃下反应3 0s， 循环3 5次； 72℃下反应5mi n， 循环1次； 4℃下保存。 7.根据权利要求5所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述引物mix由引物探针组中引物进行组合而得。 8.根据权利要求2所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述根据备选引物的序列， 获得 特异杂交探针的步骤， 包括： 根据备选引物扩增的产物序列， 设计获得第一特异探针； 将所述第一特异探针进行杂交效果测试， 获得杂交效果的测试 结果； 基于所述杂交效果的测试 结果， 选择获得 特异杂交探针。 9.根据权利要求8所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法， 其特征在 于， 所述杂交步骤 包括： 杂交： 杂交液为2 ×SSPE、 0.1％SDS和30％去离子甲酰胺， 反应温度 为45℃， 反应时间为 10min， 循环次数为1次； 杂交清洗： 杂交清洗液为2 ×SSPE和0.5％SDS， 反应温度为52℃， 反应时间为3min， 循环 次数为2次； 酶标： 酶标液为2 ×SSPE， 0.5％SDS， 0.4μg/mL  AP‑SA， 反应温度为42℃， 反应时间为 10min， 循环次数为1次； 第一次酶标清洗： 酶标清洗液 Ⅰ为2×SSPE， 0.5％SDS， 反应温度为42℃， 反应时间为 3min， 循环次数为1次； 第二次酶标清 洗： 酶标清洗液 Ⅱ为10mM Tris‑HCl， 100mM  NaCl， 5mM  MgCl2， 反应温度为权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114774587 A 3