(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210462683.7 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 西南医科 大学附属医院 地址 646000 四川省 泸州市太平街25号 (72)发明人 刘靳波　张丽梅　李宝林　 (74)专利代理 机构 成都高远知识产权代理事务 所(普通合伙) 51222 专利代理师 张娟　全学荣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测人ALDH2基因中rs671位点的 试剂盒和方法 (57)摘要 本发明涉及包含SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.2 所示引物对和SEQ  ID NO.3所示探针的用于人 ALDH2基因中rs6 71位点的试剂盒， 还涉及用于检 测人ALDH2基因中rs6 71位点的方法。 本发明试剂 盒及方法可以准确判断人ALDH2基因的基因类 型， 检测快速、 准确， 成本低， 特异性好， 灵敏度 高， 有广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114606314 A 2022.06.10 CN 114606314 A 1.SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2所示的引物对。 2.SEQ ID NO.3所示的探针。 3.SEQ ID NO.1、 SEQ  ID NO.2所示的引物对和SEQ  ID NO.3所示探针在制备检测ALDH2 基因的试剂中的用途。 4.根据权利要求3所示的用途， 其特征在于： 所述试剂是检测人ALDH2基因中rs671位点 的试剂。 5.一种用于检测人ALDH2基因中rs671位点的试剂盒， 其特征在于： 它包括SEQ  ID  NO.1、 SEQ ID NO.2所示的引物对和SEQ  ID NO.3所示的探针。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 它还包括实时荧光PCR预混液、 Taq  DNA 聚合酶、 MgCl2、 dNTP和反应缓冲液。 7.权利要求5～权利要求6所述的任意一项试剂盒在用于检测人ALDH2基因中rs671位 点中的用途。 8.一种检测人ALDH2基因中rs671位 点的方法， 其特 征在于： 它包括如下步骤： (1)提取样本DNA： 取待检组织， 提取其中的DNA； (2)基因扩增： 用权利 要求5～权利 要求6任意一项所述的试剂盒对待检样本中的DNA进 行扩增； (3)结果检测： 在95℃1min， 37℃2min， 60℃至95℃以每秒0.05℃上升并收集荧光做熔 解曲线； 其中， 所述待检组织 为全血。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于： 步骤3)所述熔解曲线中熔解峰出现在58 ± 0.5℃是野生型ALDH2基因； 熔解 峰出现在49 ±0.5℃是纯合突变型ALDH2基因； 熔解峰出现 双峰则为杂合 突变型ALDH2基因。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 所述野生型ALDH2基因的rs671位点为G； 所述杂合 突变型或纯合 突变型的ALDH2基因的rs671位 点为A。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606314 A 2一种用于 检测人AL DH2基因中r s671位点的试剂盒和方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 具体涉及一种用于检测人ALDH2基因中rs671位点的 试剂盒和方法 背景技术 [0002]人线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因位于人类第十二号染色体上。 ALDH2存在 300多 个单核苷 酸多态性(SNP)位点， 位于外显子上的rs671突变位点最为常见。 rs671位于12号外 显子上， 野生型位点为G,突变型位点为A。 分别构成三种基因型： 野生型GG， 杂合突变型GA， 纯合突变型AA。 当多态 性位点为A时， 其编码的多肽链第504位氨基酸Glu被Lys取代， 引起 酶 失活。 ALDH2在乙醇代谢中起到了极为重要的作用， 它是是乙醇代谢途径中的关键酶， 乙醇 进入人体后由乙醇脱氢酶代谢为乙醛， 再 由乙醛脱氢酶代谢为水和二氧化碳。 乙醛脱氢酶 的缺乏可以导致乙醛 的堆积， 乙醛在人体内可以刺激皮肤黏膜及上呼吸道黏膜， 导致眼球 充血、 水肿， 咳嗽胸闷甚至呼吸窘迫综合征的出现。 乙醛也可以通过肝脏代谢， 引起肝功能 受损， 最终导致酒精肝， 甚至肝硬化。 现也有相当一部分研究证明， 乙醛与癌症的发生也有 一定的相关性。 乙醛脱氢酶G/G野生型乙醛代谢能力强， 乙醛在人体内停留时间短， G/A杂合 型及A/A纯合突变型乙醛代谢能力极弱， 此类人群大量饮酒后， 易出现脸红、 恶心、 心悸等症 状， 且体内乙醛的浓度是野生型人群的10倍以上， 乙醛在体内累积， 与DNA或蛋白形成加合 物， 也可诱导活性氧的产生， 加重对肝脏细胞的损害， 这类人群不适宜饮酒。 同时， 临床心 绞 痛急性发作使用药物硝酸甘油由A LDH2代谢， 而其突变体使硝酸甘油代谢速率大大降低， 从 而无法产生一氧化氮， 难以发挥药效。 因此通过检测人ALDH2基因多态性可用于检测 “饮酒 基因”及指导硝酸甘油合理用药。 [0003]目前ALDH2基因rs671多态性的检测方法主要有PCR ‑荧光探针法、 测序法和基因芯 片法。 采用P CR‑荧光探针法检测， 用扩增曲线及ΔCt 值进行结果判定， 这种方法的不足之处 在于所设计的正常探针在检测突变位点时也会出现扩增曲线， 这种时候结果会模棱两可， 增加复查的几率， 增大了人力、 试剂的损耗。 DNA测序及基因芯片技术需要昂贵的仪器和专 业的操作人员， 并不 适合于基层医院的开展。 [0004]专利CN105063178A公开了一种基于FRET探针熔解曲线法检测ALDH2基因多态性的 试剂盒及方法， 其需要两条探针才能检测ALDH2多态性， 探针价格昂贵， 检测成本高； CN   109055560  A公开的ALDH2基因多态性检测方法的结果显示引物二聚体的熔解峰较明显， 纯 合野生型GG在88℃也会有一个干扰峰， 可见其引物设计以及探针特异性差， 有明显的非特 异扩增， 会造成结果判读失误； CN  103525904  A公开了一种利用染料法介导的熔解曲线对 ALDH2进行基因分型的ALDH2基因多态性检测方法， 由于Ev aGreen Dye染料具有非特异性， 在检测时难以与检测其 他多态性 位点同时进行， 并且有杂峰时无法判读杂峰的具体来源。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种用于检测ALDH2基因的试剂盒和方法。说　明　书 1/6 页 3 CN 114606314 A 3