(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210461641.1 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 中国农业科 学院兰州畜牧与兽药研 究所 地址 730050 甘肃省兰州市七里河区硷沟 沿335号 (72)发明人 梁春年　刘墨点　马晓明　吴晓云　 阎萍　包鹏甲　郭宪　褚敏　 喇永福　裴杰　熊琳　 (74)专利代理 机构 北京力量专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 11504 专利代理师 毛婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种牦牛MICALL2基因CNV标记的检测方法 与应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测技术领域， 具体 涉及一种牦牛MICALL2基因CNV标记的检测方法 及其应用。 本发 明提供了一种与牦牛生长性状相 关的CNV标记： 牦牛MICALL2基因候选区域Chr   29： 8990623 ‑9009740的拷贝数变异； 并提供了检 测CNV标记的方法： 以牦牛的基因组DNA为模板， 以引物对P1和P2分别通过QPCR扩增MICALL2基因 的CNV区域以及内参基因， 定量牦牛MICALL2 基因 的拷贝数变异， 所述方法准确可靠、 操作简便； 最 后本发明可在DNA水平上检测与牦牛生产性状密 切相关的CNV标记， 用于 牦牛的早期选 育。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 114657267 A 2022.06.24 CN 114657267 A 1.一种与牦牛生长性状相关的CNV标记， 其特征在于， 所述CNV标记为牦牛MICALL2基因 候选区域C hr 29： 8990623‑9009740的拷贝数变异。 2.检测权利要求1所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在检测牦牛生长性状中的 应用。 3.检测权利要求1所述牦牛生长性状相关的CNV标记的试剂在牦牛早期育种中的应用。 4.如权利要求2或3所述的应用， 其特征在于， 根据2‑ΔΔCt法定量结果， 将所述拷贝数变 异分为三类： 2‑ΔΔCt＞2时， 为插入型； 2‑ΔΔCt<2时， 为缺失型； 2‑ΔΔCt＝2为正常型； 所述正 常型 和缺失型的牦牛生长性状优于插 入型。 5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括目标基因引物对P1和参照基因 引物对P2； 所述目标基因引物对P1为： 上游引物F1： 5 ’ ‑CCGTCGTCTA ATGCCAGTGA‑3’； 下游引物R 1： 5’ ‑CATCTTTCCGCTGGACGGTA‑3’； 所述参照基因引物对P2为： 上游引物F2： 5 ’ ‑AACCAGGAGAAACTCGCCAA‑3’； 下游引物R2： 5 ’ ‑TTCGGTGAAATGCCCTCTCG‑3’。 6.一种用于检测与牦牛生长性状相关的CNV标记的引物对， 其特征在于， 所述引物对包 括目标基因引物对P1和参照基因引物对P2； 所述目标基因引物对P1为： 上游引物F1： 5 ’ ‑CCGTCGTCTA ATGCCAGTGA‑3’； 下游引物R 1： 5’ ‑CATCTTTCCGCTGGACGGTA‑3’； 所述参照基因引物对P2为： 上游引物F2： 5 ’ ‑AACCAGGAGAAACTCGCCAA‑3’； 下游引物R2： 5 ’ ‑TTCGGTGAAATGCCCTCTCG‑3’。 7.用于QPCR检测权利要求1所述CNV标记的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒含有权利 要求5所述的引物对。 8.一种与牦牛生长性状相关的CNV标记的检测方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步 骤： 以牦牛的基因组DNA为模板， 通过QPCR分别利用权利要求6所述的引物对扩增牦牛 MICALL2基因的CNV区域和参照基因BTF； 根据2‑ΔΔCt法定量结果， 将所述拷贝数变异分为三类： 2‑ΔΔCt＞2时， 为插入型； 2‑ΔΔCt<2 时， 为缺失型； 2‑Δ ΔCt＝2为正常型； 所述 正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插 入型。 9.如权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述QPCR扩增体系包括： 50ng/μL模板 DNA1 μL， 0.4pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、 下游引物各0.4 μL， SYBR  Premix Ex Taq  II 10 μL以及d dH2O 8.2 μL。 10.如权利要求8所述的检测方法， 其特 征在于， 所述 QPCR所用的反应程序为： (1)预变性： 90℃， 3 0s； (2)扩增反应： 95℃， 5s， 之后6 0℃， 30s， 45个循环； (3)绘制熔解曲线： 95℃， 5s， 之后6 5℃， 60s。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657267 A 2一种牦牛MICAL L2基因CNV标记的检测方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种牦牛MICALL2基因CNV 标记的 检测方法及其应用。 背景技术 [0002]分子育种是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择， 对畜禽的综合性 状进行品种改良。 在畜禽育种中， 通过对生长性状密切相关， 并且与数量性状紧密关联的 DNA标记的选择， 达到早期 选种和提高育种值准确性的目的， 从而在畜禽育种中获得更大的 遗传进展。 [0003]拷贝数变异(Copy  Number Variations， CNVs)， 作为一种新发现的基因组亚显微 水平结构 变异类型， 是指 基因组DNA中较大片段的缺 失或重复现象， 涉及的片段大小在50b p 到数Mb之间， 包括拷贝数增 加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy  number loss)。 [0004]CNV常用的检测 方法主要分为在全基因组范围内检测 未知CNV和用于定点检测或 验证已知CNV两类。 基因组未知CNV常用的检测方法有芯片法和测序法， 但是， 这两种方法受 检测平台的局限， 而且价格昂贵； 对于已确定的CNV的检测， 通常是采用基于P CR技术和杂交 技术的一些方法。 其中， 实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。 QPCR通过对目的基因(具有拷贝 数变异)及参考基因(无拷贝 数变异)进行相对定量， 根据 2‑ΔΔCt方法统计检测样 本候选基因 的拷贝数。 该 方法操作简单， 普适度高， 速度快， 受认同程度高。 [0005]MICAL(The  molecules  interacting  with CasL)基因家族参与动物体内多种生 理活动， 包括MICA L蛋白和MICAL样蛋白。 该基因家族 是一种直接的特异肌动蛋白调节因子。 MICALL2是MICAL家族的一员， 它由于能够结合Rab13因此也被称为Rab13效应蛋 白， 该蛋白 除了能间接结合肌动蛋白之外， 还可以结合f ‑肌动蛋白， 促进其稳定性， 此外MICALL2还 能 调节神经突触的生长 。 [0006]本发明意外发现， 所述MICALL2基因位于CNV区域， 因此提供了一种与牦牛生长性 状相关的CNV标记， 并提供了一种方便、 准确、 大样本量的检测牦牛MICALL2 ‑CNV的检测方 法， 为牦牛的生长性状的早期选 育提供了基础。 发明内容 [0007]针对现有技术存在的问题， 本 发明提供了一种牦牛MICALL2基因CNV 标记的方法及 其应用， 尤其涉及一种 基于QPCR技术检测牦牛MICALL2基因CNV标记的方法及其应用。 具体 包括以下内容： [0008]第一方面， 本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的CNV标记， 所述CNV标记为牦 牛MICALL2基因候选区域C hr 29： 8990623‑9009740的拷贝数变异。 [0009]优选地， 根据2‑ΔΔCt法定量结果， 将所述拷贝数变异分为三类： 2‑ΔΔCt＞2时， 为插入 型； 2‑ΔΔCt<2时， 为缺失型； 2‑ΔΔCt＝2为正常型； 所述正常型和缺失型的牦牛生长性状优于插 入型。说　明　书 1/6 页 3 CN 114657267 A 3