(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221047595 0.4 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 深圳大学 地址 518060 广东省深圳市南 山区南海大 道3688号 (72)发明人 陈雯雯　刘晓蕾　王纪东　许颖　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 潘登 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12M 1/34(2006.01)C12M 1/38(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种以非疾病诊断为目的的细胞定量及基 因分型方法 (57)摘要 本发明公开了一种以非疾病诊断为目的的 细胞定量及基因分型方法。 所述方法包括： 将样 本中的细胞、 PCR反应试剂、 PCR引物和探针以及 细胞裂解试剂封装在液滴中， 其中在所述液滴中 存在至少一个细胞； 利用所述液滴进行PCR， 将 PCR反应后的液滴进行阵列排布， 检测每个液滴 的荧光强度， 结合泊松分布公式计算样本中目标 细胞的数量， 并进行基因分型分析。 所述方法无 需进行繁琐的细胞富集步骤及单细胞分析， 而是 基于液滴微流控平台， 将待测血液标本均匀地分 入上百万个相互独立的液滴中， 无需依赖标准曲 线， 结合泊松分布公式即可实现细胞绝对定量， 且可在单个反应内实现基因分型分析， 操作简 单， 适合广泛推广应用。 权利要求书2页 说明书13页 序列表2页 附图7页 CN 114921532 A 2022.08.19 CN 114921532 A 1.一种以非疾病诊断为目的 的细胞定量及基因分型 方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 将样本中的细胞、 PCR反应试剂、 PCR引物和探针以及细 胞裂解试剂封装在 液滴中， 其中 在所述液滴中存在至少一个细胞； 利用所述液滴进行PCR， 将PCR反应后的液滴进行阵列排布， 检测每个液滴的荧光强度， 结合泊松分布公式计算样本中目标细胞的数量， 并进行基因分型分析。 2.根据权利要求1所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在 于， 所述PCR引物和探针包括针对目标细胞中基因的引物和探针； 优选地， 所述目标细胞包括循环肿瘤 细胞或BCR ‑ABL融合基因突变细胞； 优选地， 所述循环肿瘤 细胞包括宫颈癌细胞； 优选地， 所述基因包括HPV16和/或HPV18； 优选地， 所述探针为TaqMan探针。 3.根据权利要求2所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在 于， 所述HPV16的正向引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.1所示的序列； 优选地， 所述HPV16的反向引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.2所示的序列； 优选地， 所述HPV16的探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.3所示的序列。 4.根据权利要求2所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在 于， 所述HPV18的正向引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.4所示的序列； 优选地， 所述HPV18的反向引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.5所示的序列； 优选地， 所述HPV18的探针的核酸序列包括SEQ  ID NO.6所示的序列。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在于， 所述封装包括将样本中的细胞、 P CR反应试剂、 P CR引物和探针以及细胞裂解试 剂和油相注入液滴 生成芯片； 优选地， 所述液滴生成芯片设置有腔室及与所述腔室连通的油相入口、 细胞相入口、 试 剂相入口和油包水 液滴出口； 优选地， 所述油相包括氟油。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在于， 所述阵列排布包括将PCR反应后的液滴注入液滴读取芯片进行阵列排布； 优选地， 所述液滴读取芯片设置有油包水 液滴入口、 液滴读取区域及废液相出口。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在于， 所述PCR的程序为： 40～60℃预孵育1～5mi n； 90～98℃预变性15～3 0s； 90～98℃、 1～5s， 5 5～65℃、 25～3 5s， 共30～40个循环； 45～55℃、 30～90s。 8.根据权利要求1 ‑7任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其特征在于， 所述阵列排布后还包括使用荧光共聚焦显微镜记录每个液滴的明场及荧光场 图像得步骤； 优选地， 所述目标细胞的数量的计算方法包括： 根据阴性对照液滴的荧光强度划定阈值， 统计阳性液滴与阴性液滴的数目， 计算样本权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921532 A 2中的阴性液滴占总液滴的比例， 根据泊松分布公式， 计算出目标细胞的数量； 优选地， 所述基因分型分析的方法包括 根据不同的荧 光通道实现基因分型。 9.如权利要求1 ‑8任一项所述的以非疾病诊断为目的的细胞定量及基因分型方法， 其 特征在于， 所述方法包括以下步骤： (1)将样本中的细胞通过细胞相入口， PCR反应试剂、 PCR引物和探针以及细 胞裂解试剂 通过试剂相入口， 以及氟油通过油相入口注入液滴生成芯片， 从油包水液滴出 口接出油包 水液滴； (2)取油包水液滴进行PCR反应， 将PCR反应后油包水液滴通过油包水液滴入口注入液 滴读取芯片， 油包水液滴阵列排布在腔室中， 使用荧光共聚焦显微镜记录每个液滴的明场 及荧光场图像， 检测每个液滴的荧光 强度， 根据阴性对照液滴的荧光 强度划定阈值， 统计阳 性液滴与阴性液滴的数目， 计算样 本中的阴性液滴占总液滴的比例， 根据泊松分布公式， 计 算出目标细胞的数量， 根据不同的荧 光通道实现基因分型。 10.一种细胞定量及基因分型装置， 其特征在于， 所述装置应用于权利要求1 ‑9任一项 所述的以非疾病诊断为目的 的细胞定量及基因分型 方法中； 所述装置包括液滴 生成单元、 反应单 元和分析 单元； 所述液滴 生成单元用于执 行包括以下操作： 将样本中的细胞、 PCR反应试剂、 PCR引物和探针以及细 胞裂解试剂封装在 液滴中， 其中 在所述液滴中存在至少一个细胞； 所述反应单 元用于执 行包括以下操作： 利用所述液滴进行PCR； 所述分析 单元用于执 行包括以下操作： 将PCR反应后的液滴进行阵列排布， 检测每个液滴的荧光强度， 结合泊松分布公式计算 样本中目标细胞的数量， 并进行基因分型分析。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921532 A 3