(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210465769.5 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市通沙路898号 南 楼七层 (72)发明人 赵媛　胥传来　魏春豪　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 专利代理师 杨慧林 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂及细 辛属物种的荧 光检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种检测辽细辛DNA条形码的 试剂及辽细辛的荧光检测方法。 本发 明所述试剂 包括包括AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物、 荧光标记物 修饰的辽细辛特异性下游引物， 所述 辽细辛引物特异性上游引物、 荧光标记物修饰的 辽细辛特异性下游引物序列分别： 5 ’‑SH‑ (CH2)6‑ATTGACCACGCGAACTTGTGA ‑3’； 5’ ‑荧光标 记物‑ACCGTCAACAAACCTGATTGCT ‑3’。 检测方法： 将AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物、 荧光标 记物修饰的辽细辛特异性下游引物与含有待测 细辛属物种DNA模板 溶液混合进行PCR反应扩增， 并检测所得产物的荧光光谱值， 实现 辽细辛的定 性或定量检测。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114921579 A 2022.08.19 CN 114921579 A 1.一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂， 其特征在于， 包括AuNPs修饰的辽细辛特异 性上游引物d d‑AH‑R、 荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物d d‑AH‑F， 其中， 所述辽细辛特异性上游引物dd ‑AH‑F、 荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物 dd‑AH‑R序列分别： 5’‑SH‑(CH2)6‑ATTG ACC ACG CG AACTTG TG A ‑3’； 5’‑荧光标 记物 ‑ ACCGTCAACAAACCTGATTGCT‑3’。 2.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 还包括DNA聚合酶、 DNA模板、 水、 缓冲溶液 与dNTP。 3.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 所述荧光标记物选自Cy5、 Cy5.5、 Cy3或 ROX。 4.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 所述AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物 通过以下方法制备得到： 将AuNPs与辽细辛的上游引物dd ‑AH‑F溶液混合反应， 之后加入氯 化盐溶液并反应， 得到所述AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物。 5.根据权利 要求4所述的试剂， 其特征在于， 所述AuNP s与辽细辛的上游引物dd ‑AH‑F的 摩尔比为1:3 00‑500。 6.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 所述细辛属物种选自单叶细辛、 花叶尾花 细辛、 辽细辛或长毛细辛。 7.一种检测细辛属物种的荧光检测方法， 其特征在于， 使用权利要求1 ‑6任一项所述的 试剂进行检测。 8.根据权利 要求7所述的荧光检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将AuNP s修饰的辽 细辛特异性上游引物、 荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物与含有待测细辛属物种 DNA模板溶液混合进行PCR反应扩增， 并检测所得产物的荧光光谱值， 实现细辛属物种的定 性或定量检测。 9.根据权利要求8所述的荧光检测方法， 其特征在于， 所述定量检测的标准曲线通过以 下方法制备得到： 将一系列不同浓度的细辛属物种DNA模板进行PCR体系扩增， 在激发波长 610nm， 发射波长670nm， 检测所得产物的荧光强度值， 得到以细辛属物种DNA模板浓度的对 数值为横坐标、 以F0‑F为纵坐标的标准曲线， 其中F0为空白的荧光强度值， F为 所得产物的荧 光强度值。 10.根据权利要求9所述的荧光检测方法， 其特征在于， 所述细辛属物种DNA模板的浓度 为0.1×10‑4‑0.4×101ng/ μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921579 A 2一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂及细辛属物种的荧光 检测方法 技术领域 [0001]本发明属于光谱分析技术领域， 尤其是指一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂 及细辛属物种的荧 光检测方法。 背景技术 [0002]辽细辛(学名： Asarum  heterotropoides  F.Schmidt  var.mandshuricum   (Maxim.)Kitag.)是马兜铃科， 细辛属多年生草本植物。 细辛属多数种类主要成分为甲基丁 香酚、 黄樟醚、 细辛酮、 沈香酸、 大屯细辛酮以及 有强心作用的生物碱。 马兜铃酸早在2002年 就被世界卫生组织(WHO)列入第一类致癌物。 近些年来， 人们在饮食保健上投入也慢慢增 多。 中草药剂药丸而造成马兜铃酸中毒的事件频频发生。 原料来源不明或成分组成不明的 食物会对食品安全带来巨大的风险与隐患。 同时细辛属植物作为的中草药入药的部位不 同， 在市面上贩卖时无法整体整株展现， 造成 中草药药品混淆， 掺假贩卖。 因此准确、 快速的 鉴定食品中的细辛成分十分重要。 [0003]近十年来， 多种分子生物学技术已应用于鱼类的快速鉴定， 例如： DNA  条形码技术 (DNA Barcoding)、 PCR技术、 限制性片段长度多态性技术  (Restriction  Fragment  Length  Polymorphism， RFLP)、 随机扩增多态性DNA  技术(RandomAmplifiedPolymorphic  DNA， RAPD)、 扩增片段长度多态性技术(AmplifiedFragment  LengthPolymorphism， AFLP)以及基 因芯片技术等， 但从目前已有报道来看， 所有研究只针对马兜铃科物种生物形态学鉴定， 成 分质谱鉴定。 因此建立快速检测方法， DNA条形码荧光检测辽细辛的光谱分析方法满足市场 监管， 食品安全监管的检测检验需求具有重要意 义。 发明内容 [0004]为解决上述技术问题， 本发明提供了一种检测细辛属物种DNA条形码的试剂及细 辛属物种的荧 光检测方法。 [0005]本发明的第一个目的在 于提供一种检测细辛属物种D NA条形码的试剂， 包括AuNPs 修饰的辽细辛特异性上游引物、 荧 光标记物修饰的辽细辛特异性下游引物， [0006]所述辽细辛引物特异性上游引物dd ‑AH‑F、 荧光标记物修饰的辽细辛特异性下游 引物dd‑AH‑R序列分别：  5’ ‑SH‑(CH2)6‑ATTGACCACGCGAACTTGTGA‑3’； [0007]5’ ‑荧光标记物‑ACCGTCAACAAACCTGATTGCT‑3’。 [0008]在本发明的一个实施例中， 所述辽细辛引物通过细辛属物种通用 引物测序筛选得 到， 其中， 细辛属物种通用引物的上、 下游引物Asa ‑F、 Asa‑R的序列分别为： 5 ’‑ TATCTCTTTCTTTTTTTCAAAAGG‑3’； 5’ ‑ATGGGCTTTTGCCAATGAGCCAATC‑3’。 [0009]在本发明的一个实施例中， 还 包括DNA聚合酶、 DNA模板、 水、 缓冲溶 液与dNTP。 [0010]在本发明的一个实施例中， 所述 荧光标记物选自Cy5、 Cy5.5、 Cy3或  ROX。 [0011]在本发明的一个实施例中， 所述AuNPs修饰的辽细辛特异性上游引物通过以下方说　明　书 1/5 页 3 CN 114921579 A 3